黃芪注射液對結腸癌SW480細胞的生長抑制作用

樊占兵，李 明，魏雙江，秦彩娟，肖慶旺

河北省灤縣人民醫院普外一科，河北灤縣 063700

黃芪注射液是我國開發的一種中藥制劑，目前在臨床上已得到廣泛運用，能提高患者免疫力。有關黃芪注射液抗腫瘤作用的相關研究，國內外報道非常少。本文將黃芪注射液對人結腸癌SW480細胞體外抑制及誘導凋亡的作用實驗結果報道如下：

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

流式細胞儀(Bechman Coulter公司，EPICS-XL型)；Bio-Tek酶聯免疫檢測儀 (PE公司，型號ELX-800)；人結腸癌SW480細胞(中國科學院上海細胞生物所)；黃芪注射液(成都地奧九泓制藥廠，批號：9709008)；奧沙利鉑(L-OHP，江蘇恒瑞醫藥公司)；小牛血清(浙江省杭州四季青生物公司)；四甲基噻唑氮藍(MTT，Fluka公司)；二甲基亞砜(SIGMA 公司)；胰蛋白酶(Amresco公司)；RPMI1640培養液(美國GIBCO公司)；碘化丙啶(PI)(美國Sigma公司)；

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 SW480細胞用加10%小牛血清的RPMI1640培養液，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2 MTT法檢測對數生長期SW480細胞 實驗分為空白對照組、奧沙利鉑對照組（20 μg/ml）和黃芪注射液實驗組（125、250、500、1 000 μg/ml），每組設 3 個復孔，以不含細胞的RPMI 1640培養液為空白對照組(調零組)，各組細胞按不同處理后培養48 h，檢測時加入20 μl MTT（濃度為5 mg/ml），繼續孵育4 h，棄上清后每孔加二亞基甲砜150 μl，振蕩溶解，酶聯檢測儀測定570 nm波長處的吸光度OD值（λ=570nm）。細胞增殖抑制率計算：細胞抑制率(%)=[（對照組OD-實驗組OD）/對照組 OD]×100%。

1.2.3 PI細胞染色FCM法檢測SW480細胞凋亡 取常規傳代的SW480細胞，每組3瓶，用含0.1%小牛血清的RPMI-1640培養基處理24 h進行細胞周期同步化后，分別加入不同濃度的藥物。培養48 h對數生長期收集細胞，2 000 r/min離心10 min，棄上清液，振蕩，無菌PBS洗滌，重復3次。振蕩后加入-4℃的95%乙醇1 ml固定，上流式細胞儀檢測細胞周期分布及細胞凋亡率。

1.3 統計學方法

應用SPSS12.0統計軟件進行統計分析，采用單因素方差分析，檢驗水準取α=0.05，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 形態學觀察

普通高倍顯微鏡400倍下觀察，加藥后SW480細胞數量減少，細胞體積縮小，變圓，折光性差，細胞脫落漂浮，胞漿濃縮，核染色質固縮，細胞核碎裂。

2.2 MTT法檢測黃芪注射液對SW480細胞的抑制作用

與空白對照組比較，125 μg/ml以上濃度的黃芪注射液對SW480細胞生長增殖有明顯的抑制作用，且與作用濃度呈正比（P=0.000＜0.01）。 結果見表1。

表1 MTT法測定黃芪注射液對SW480細胞的抑制作用（±s，n=3）

表1 MTT法測定黃芪注射液對SW480細胞的抑制作用（±s，n=3）

注：與空白對照組比較，*P＜0.01

組別空白對照組奧沙利鉑對照組黃芪注射液實驗組125 μg/ml 250 μg/ml 500 μg/ml 1 000 μg/ml OD 值（λ=570 nm）1.372±0.001 0.897±0.012 1.177±0.213 0.891±0.013 0.690±0.089 0.383±0.141抑制率（%）0 34.6*14.2*35.1*49.7*72.1*

2.3 流式細胞儀FCM法分析結果

空白對照組SW480細胞自然凋亡率為0.86%，奧沙利鉑20 μg/ml對照組凋亡率為9.41%，黃芪注射液作用SW480細胞 48 h 后，125、250、500、1 000 μg/ml各組的凋亡率分別為24.2%、42.6%、64.1%、84.0%。細胞周期分析提示，加用黃芪48 h后G1期細胞數量增多，S期細胞數量減少，黃芪注射液使SW480細胞的生長停滯在G1期，并且促進G1期細胞凋亡，并在一定范圍內呈濃度依賴性。統計分析表明125 μg/ml以上濃度的黃芪注射液組SW480細胞凋亡率較空白對照有明顯升高，有顯著性差異（P=0.000＜0.01）（表2）。

表2 FCM法分析黃芪注射液對SW480細胞周期和凋亡率的影響（%）

3 討論

黃芪注射液是常用的一種補氣用藥制劑，具有補氣升陽、益衛固表等功效。黃芪中含有黃芪多糖、黃芪皂苷、黃酮類、多種氨基酸及鐵、錳、鋅、硒等多種微量元素。這些成分具有不同的生物學活性，如清除氧自由基，增加巨噬細胞吞噬病毒的抗病毒能力，具有多方面的免疫調節和免疫增強作用，具有雙向調節免疫功能，是一種免疫調節劑[1-3]，提高機體抗病能力。目前大多數研究人員認為黃芪抗癌作用并非藥物直接殺滅癌細胞，而是通過對機體的免疫調節，誘導淋巴細胞產生IL-2和IFN，直接或間接參與細胞因子和免疫系統的調控，從而達到誘導癌細胞凋亡。據報道[4-9]黃芪注射液可以用于大腸癌患者手術化療后免疫功能低下的治療，增強化療藥物療效，減少細胞毒性藥物的損傷，保護骨髓維護造血功能，提高患者生存質量，延長生存期，取得較佳治療效果。

大腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，發病率居肺癌、乳腺癌之后而占第三位。近年各地資料顯示其發病率呈逐年上升趨勢，嚴重威脅著人們的健康與生命[10]。目前常用的化療藥物存在選擇性低，毒性大，價格貴，易產生耐藥性等缺陷。因此尋找靶向性強，毒性低，價格優惠，分子量小，易穿透腫瘤組織的新型藥物是抗腫瘤新藥開發研究的發展方向。大多數化療藥物都通過誘導腫瘤細胞凋亡，因此其可能是不同機制抗癌藥物發揮作用的共同通路[11]。劉成軍等[12]報道黃芪注射液能抑制人類小涎腺腺樣囊性癌細胞株增殖并誘導細胞凋亡。李瓊等[13]發現黃芪注射液對人乳腺癌細胞株MDAMB-435的體外增殖具有抑制作用。Tin等[14]研究表明黃芪可以作為結腸癌有效的化療制劑或配合傳統化療治療結腸癌，目前機制不明。因此我們嘗試應用黃芪注射液行體外實驗，探討其是否誘導人結腸癌SW480細胞凋亡，尋找其作用機制。

本實驗以不同濃度的黃芪注射液不同時間直接作用于人結腸癌SW480細胞株，普通光鏡下觀察細胞形態學變化，結果顯示癌細胞數量減少，細胞體積縮小，變圓，折光性差，細胞脫落漂浮，胞漿濃縮，核染色質固縮，細胞核碎裂。通過MTT法檢測發現，黃芪注射液對SW480細胞生長增殖有明顯的抑制作用，且與作用濃度呈正比。本實驗還通過FCM法檢測黃芪注射液對SW480細胞生長周期的影響，結果表明對照組SW480細胞自然凋亡率為0.86%，黃芪注射液作用SW480 細胞 48 h 后，125、250、500、1 000 μg/ml各組的凋亡率分別為24.2%、42.6%、64.1%、84.0%。細胞周期分析顯示實驗組黃芪注射液對人結腸癌SW480細胞的體外增殖具有抑制作用，并能促使SW480細胞阻滯于G1期，誘導SW480細胞凋亡。本研究為黃芪注射液用于臨床治療大腸癌患者提供了有力的依據。

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