急性分離大鼠皮層神經元的方法與體會

王 壯 ，劉 富 ，紀 慧 ，田 華

1.齊齊哈爾醫學院成人及繼續教育學院學工辦，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾醫學院解剖教研室，黑龍江齊齊哈爾 161006；3.齊齊哈爾醫學院基礎醫學院辦公室，黑龍江齊齊哈爾 161006；4.齊齊哈爾醫學院藥理教研室，黑龍江齊齊哈爾 161006

近年來，研究細胞膜離子通道活動的主要方法是膜片鉗技術，而獲得活力好的神經元便成為應用膜片鉗技術的重要先決條件。許多離子通道研究是需要單個分散的神經元，人工培養的神經細胞易受培養環境的影響，自身特性改變較大，而急性分離的細胞卻能相對保持完好的生理特性[1-3]。筆者結合文獻并加以改進，摸索出一種簡便易行的適用于全細胞膜片鉗研究的大鼠頂葉皮層神經元急性分離方法，現報道如下：

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Wistar大鼠，10～16 d，雌雄不限，由哈爾濱醫科大學附屬二院動物研究中心提供。

1.2 試劑

胰蛋白酶(Protease)、四乙胺(TEA)、4-氨基 吡啶(4-AP)、EGTA、HEPES、CsCl，均為 Sigma 公司產品，其余為國產分析純試劑。

1.3 大鼠皮層神經元的急性分離

斷頭取大腦皮層，切成厚約0.4 mm的冠狀腦片，置于通有95%O2和5%CO2混合氣體的人工腦脊液[ACSF（mmol/L）：NaCl 142， KCl 5， CaCl22， MgSO42， D-Glucose 10， HEPES 10，pH 7.3，32℃]中孵育1 h后，再在通有95%O2和5%CO2混合氣體的0.1%胰蛋白酶（用ACSF配制）溶液中消化30 min。消化好的腦片以ACSF沖洗、剪碎，以尖端拋光的Pasteur吸管（口徑分別為 500、300、150 μm）依次吹打，使組織塊分散，吹打成細胞懸液，靜置2～4 min后，吸取上清液，滴于有飽和氧細胞外液（mmol/L，NaCl 130、KCl 5.4、CaCl21、MgCl21、Glucose 25、HEPES 10、CdCl20.2，pH7.3） 的培養皿中， 靜置20 min細胞貼壁后進行膜片鉗實驗。整個實驗在20～25℃下進行。

1.4 全細胞記錄方

對神經元電生理的膜片鉗研究，要求細胞的膜光滑完整、清潔、狀態良好，破膜后對其細胞活性仍能保持很長一段時間[4]。選取狀態良好的神經元進行實驗。電極內預先灌注電極內液，通過三維微操縱儀使電極進入細胞外液，顯示器上可見封接測試脈沖，其大小代表電極電流，并可顯示據此計算出的電極電阻，通常為2～4 MΩ。當電極尖與細胞表面接觸時，由于電極電阻的突然增加，電極電流會減小，細胞膜出現顫動，給予電極以一定的負壓，顯示器上的測試脈沖逐漸減小，成為直線，并出現大小相同、方向相反的電容瞬流，其由電極夾持器和電極管壁形成。此時電阻顯示＞1 GΩ，表明形成高阻封接。調節放大器上的快電容補償旋鈕以抵消此電容電流。然后給予快速負壓或向細胞膜施加以一短脈沖使電極吸附處的細胞膜破裂，電極液與細胞液相通從而形成全細胞記錄。此時出現來自細胞膜較大的跨膜電流瞬流，調節放大器上的慢電容補償旋鈕和串聯電阻補償旋鈕以抵消電容電流和串聯電阻造成的電壓降。即可在電壓鉗模式下，進行電流的觀察和記錄。數據分析用Clampfit 8.2軟件處理。

2 結果

2.1 急性分離的大鼠皮層神經元形態學觀察

倒置相差顯微鏡下，分離完整的神經元表面光潔，有較強的光暈，而且有較長的突起。細胞胞體呈現錐形、橢圓形或三角形，胞質均勻，折光性好；一般有1個頂樹突和2個或多個基數突。完整的神經細胞在人工腦脊液中可維持其形狀6 h以上（圖 1）。

2.2 離子通道研究

用錐體細胞作為研究對象，利用前述標準細胞外液，采樣參數文件保持電位-80 mV，從-40 mV去極化到+60 mV，共10個階躍，每個階躍增加10 mV去極化，脈沖寬度為100～300 ms，刺激頻率為1 Hz。全細胞電壓鉗制條件下記錄出的原始電流如圖2A，可見電流分內向電流和外向電流，內向電流可被1 μmol/L河豚毒阻斷，用CsCl代替電極內液的KCl，則外向電流被1 mmol/L 4-AP和10 mmol/L TEA大部分阻斷，向該細胞附近添加TTX和4-AP后，可以記錄到延遲整流鉀電流IK（圖2B）。在細胞外液中添加TTX和TEA后，可以記錄到瞬間外向鉀電流IA（圖2C）。

3 討論

3.1 動物的選擇

理論上鼠齡越小的大鼠皮層神經元耐受缺氧能力越強，活性越好，分離的效果也越好。鼠齡過大神經元突起較多較長，分離時容易損傷，分離出來的細胞易于封接但破膜比較困難；鼠齡過小神經元未分化成熟，記錄出的通道電流較小，且在破膜時負壓稍大即可將細胞吸入電極內。根據本實驗，選擇鼠齡在10～16 d的幼鼠為宜，最佳時間為13 d。

3.2 大鼠皮層神經元的急性分離

膜片鉗記錄成功的關鍵是分離完整的、表面光潔的、存活時間較長的錐體細胞。急性分離過程中需要注意的主要關鍵問題如下：①電極內預先灌注電極內液，為防止電極尖的阻塞，可對電極液進行濾膜過濾。電極內可以給予正壓以防止電極尖吸附灰塵和顆粒。②孵育及標準細胞外液pH值，酶濃度及作用時間是影響細胞狀態的關鍵應嚴格控制。③腦片制備：取材時不要擠壓腦組織，以免造成損傷。動作要迅速，腦片制備必須在通氧的冰ACSF中進行，腦片對缺氧敏感，在孵育及酶處理過程中必須連續供給氧氣。通氣時注意防止腦片隨氣泡翻動。④消化酶隨用隨配，防止酶活力下降[5-7]。酶解過程中的酶量與酶解時間要嚴格控制，酶量增加會導致細胞消化過度，膜片鉗記錄時間縮短；酶量不足導致細胞消化不夠，不易破膜，難以形成全細胞膜片鉗記錄模式。⑤腦片薄厚切得要適中，過厚不利于氧氣透過造成細胞缺氧，過薄則機械性損傷較大。⑥腦片吹打[8]：選擇口徑大小合適的吹打管，從粗到細依次吹打腦片（口徑分別為 500、300、150 μm），效果較好。吸管直徑過大或過小，均會造成損傷，不能得到狀態良好的神經元。此外，吹打腦片動作要輕柔，否則加重細胞損傷。

本實驗分離的大鼠皮層細胞具有明顯的突起，細胞膜表面光潔、光暈好。用全細胞膜片鉗技術在急性分離的細胞上記錄到上述全細胞鈉、鉀電流，實驗結果表明利用該方法急性分離皮層神經元，可用于膜片鉗技術探究大腦皮層離子通道及其信號轉導機制，為深入了解大腦皮層的功能及其相關疾病發生機制和藥物治療研究奠定基礎。

[1]韓濟生.神經科學原理 [M].2版.北京：北京醫科大學出版社,1999：1084-1103.

[2]高秀萍,張宇.大鼠海馬神經元急性分離法[J].山西醫科大學學報,2003,34(3)：197-198.

[3]楊雷,李玉榮,蘇莉芬,等.大鼠皮層神經元急性分離改良方法[J].哈爾濱醫科大學學報,2005,39(3)：285-287.

[4]鄒飛,高天明,陳培熹.適用于膜片鉗研究的成年大鼠腦神經元急性分離法[J].中國應用生理學雜志,1995,11(1)：27-81.

[5]李剛,程立君,林凌,等.小鼠海馬神經元急性分離和膜片鉗技術的應用[J].天津大學學報,2008,41(10)：1157-1160.

[6]笱玉蘭,羅利俊,陳國華,等.改良的適用于膜片鉗研究的大鼠海馬神經元急性分離法[J].中國康復,2010,25(6)：416-418.

[7]李從德,陸永利,楊紅衛,等.以膜片鉗技術急性分離新生大鼠尾核神經元[J].中國組織工程研究與臨床康復,2009,13(37)：7322-7325.

[8]馮冠青,趙世剛,楊雷,等.大鼠海馬錐體神經元的急性分離方法[J].內蒙古醫學雜志,2009,41(8)：912-914.