固本補腎湯對前列腺基質細胞增殖的影響

朱 閩，覃兆偉，荀建寧，梁永協，周 凱

廣西中醫學院附屬瑞康醫院男性科，廣西南寧 530011

良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）多見于老年人，發病率隨著年齡的增加而呈上升趨勢[1]。迄今為止BPH的發病機制尚未完全明了，但總是細胞增殖和細胞凋亡共同作用的結果。筆者為探討固本補腎湯治療BPH的作用機制，進行了體外人前列腺基質細胞的培養，用四氮唑藍法（MTT）檢測藥物對體外培養人前列腺基質細胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 標本來源 本次研究細胞培養用的前列腺組織塊取自經恥骨上前列腺摘除術切除的前列腺標本，每分標本重量2～3 g，經組織學證實為BPH組織。

1.1.2 主要實驗試劑 1640培養液（美國Glbco公司），DMEM培養液（美國Glbco公司），胎牛血清（美國Gibco公司），馬血清（美國 Gibco公司），MTT（美國 Sigma公司），二甲基亞砜（美國Sigma公司），逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）試劑盒TakaPa RNA PCR Kit(Amv)Ver3.0（武漢博士德生物有限公司），Trizol核酸提取液（美國sigma公司）。

1.1.3 主要實驗儀器 CO2恒溫培養箱（TC2323型，美國Sheloln），超凈工作臺（蘇州真田潔凈設備有限公司），相差倒置顯微鏡（ECLIPSETE300型，日本Nikon公司），96孔培養板，25 cm2培養瓶（日本Nuco公司產品），PCR基因擴增儀（TC-48/T/H（a）杭州大和株式會社），電泳儀（杭州大和株式會社），DU640核酸/蛋白分析儀（美國 BECKMAN COULTER）。

1.2 實驗藥物

固本補腎湯方藥：黃芪15 g、黨參10 g、枸杞子12 g、丹參15 g、當歸12 g、肉蓯蓉10 g、王不留行15 g等。按劑量以農本方（香港培力南寧藥業有限公司提供，每一味中藥濃縮劑均已獨立取得國家正式生產批文）溶于Hank's中，用細胞培養液稀釋至1 g/ml，1 500 r/min，離心5 min去除沉淀，用0.22 μm微孔濾膜濾過除菌，4℃保存備用。枸櫞酸他莫昔芬片：由上海華聯制藥有限公司生產（國藥準字H10910072），10 mg/片，用Hank's液溶解，用細胞培養液稀釋配制成1 ng/ml，制備方法同前。

1.2 方法

1.2.1 前列腺基質細胞原代、傳代培養及純化、鑒定 在超凈臺上將前列腺組織剪為約1 mm3大小，采用組織塊貼塊法進行接種，參照文獻[2-3]進行原代及傳代培養（基質細胞培養液中加入雌二醇作為促增生劑），采用自然純化法、機械化除法、差速貼壁法純化基質細胞。培養3～4代后基本上可得到純化的基質細胞，采用RT-PCR法檢測平滑肌分化特異性蛋白smoothelin的表達（smoothelin片段：上游引物5-GGTCGAAGATGCTGCCCATCTT-3′、下游引物 5′-TCCGACAAAGGAAGAGAGACC-3′、片段長度為 324 bp；同時以 β2微球蛋白引物擴增片段作為內參標：上游引物5′-AGAGCTACCTGTGGAGCAACCT-3′、下游引物 5′-ATGCCTGCCGTGTGAACCATGT-3′、片段長度為285 bp），檢測結果基質細胞純度達98%。

1.2.2 實驗藥物細胞毒性實驗 將制備的固本補腎湯溶液用DMEM培養液以幾何比稀釋，對基質細胞培養24 h后，觀察細胞情況，并根據光密度（optic density，OD）值計算藥物對細胞的毒性作用[公式為：（藥物組平均OD-空白組平均OD）/空白組平均OD×100%]，取毒性作用＜15%的濃度作為觀察濃度。按細胞毒性實驗結果，設實驗藥物高（10 ng/ml）、中（1 ng/ml）、低劑量組（0.1 ng/ml），他莫昔芬組，并設模型對照組及空白對照組，進行干預培養，每組重復5瓶。

1.2.3 MTT法檢測固本補腎湯對前列腺基質細胞的增殖作用影響 取第4代細胞懸液以4×104/ml濃度接種于96孔板，每孔500 μl，培養24 h使細胞貼壁，用Hank's液沖洗2次。換成含0.5%進口馬血清的DMEM培養液24 h后，同時每孔加入含藥細胞培養液，每孔加500 μl，每濃度4個復孔，設他莫昔芬對照組5個，并設模型對照組5個，不含藥物，而加入等量的培養液（含雌二醇），另設空白對照組5個（培養液中不含雌二醇），在37℃，5%CO2恒溫箱中放置24 h，在每孔中加5 mg/ml MTT 20 μl，同樣條件下培養 4 h，終止培養，吸取孔內培養液，每孔加入100 μl的二甲基亞砜，室溫下震蕩5 min，使結晶物充分溶解，在590 nm處測OD值。

1.3 統計學方法

采用SPSS 18.0軟件統計分析，數據以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用q檢驗。

2 結果

在24 h時，他莫昔芬組及固本補腎湯各劑量組對細胞生長有都明顯的抑制作用，與模型組比較，差異有高度統計學意義（P＜0.01）；固本補腎湯各劑量組之間比較，差異有統計學意義（P＜0.01、P＜0.05）；低劑量組與他莫昔芬組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），中、高劑量組與他莫昔芬組比較，差異有統計學意義（P＜0.01、P＜0.05）。 見表1。

表1 固本補腎湯對基質細胞增殖的影響（OD 590 nm，±s）

表1 固本補腎湯對基質細胞增殖的影響（OD 590 nm，±s）

注：方差分析：F（OD）值=46.480，P＜0.01；與空白組比較，*P＞0.05，△P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.01；與他莫昔芬組比較，#P＞0.05，○P＜0.05，●P＜0.01；與低劑量組比較，☆P＜0.01，★P＜0.05；與中劑量組比較，◇P＜0.05

組別 例數 OD值空白組模型組他莫昔芬組低劑量組中劑量組高劑量組555555 0.189±0.004 0.273±0.023△0.190±0.005*▲0.198±0.004*▲#◇0.211±0.008△▲○★0.226±0.004△▲●☆

3 討論

BPH是由于前列腺上皮或基質細胞增生，引起的一系列下尿路梗阻癥狀，但BPH患者的臨床癥狀并不與增生的前列腺腺體大小成正比[4]組織學的研究提示了前列腺基質成分在BPH發病中的重要性[5]。歷代醫家多將其歸屬于中醫“癃閉”的范疇。現行的中華人民共和國中醫藥行業標準《中醫病證診斷療效標準》正式將其定名為“精癃”，病位在膀胱與精室。

《景岳全書·積聚》云：“凡脾腎不足及氣弱失調之人，多有積聚之病。”本病多由于年老體弱，或因年老陰陽氣衰而致脾虛，氣化無力，日久痰濁瘀血留滯而成，屬本虛標實。劉猷枋教授也提出腎氣虛、氣化不利和瘀血內阻是BPH發生的最重要因素[6]。固本補腎湯方中黃芪、黨參益氣利水，大補脾氣而達到氣化得行，則小便自通的目的；丹參、當歸活血化瘀，破宿血、補新血；王不留行活血通絡、利尿通淋；枸杞子、肉蓯蓉以補腎化氣。全方以益氣活血為主，輔以補腎之品，以達到補腎化氣、活血散結的作用。

本次研究通過MTT法檢測了固本補腎湯對體外培養人前列腺基質細胞增殖的影響，結果表明固本補腎湯能抑制體外培養前列腺基質細胞的增殖，這可能是固本補腎湯治療良性前列腺增生癥的作用機制。

[1]劉本臣.中醫藥治療良性前列腺增生癥的研究進展[J].甘肅中醫,2007,20(12)：68-70.

[2]鄂征.組織培養和分子細胞學技術[M].北京：北京出版社,2001：35-38.

[3]司徒鎮強,吳軍正.細胞培養[M].西安：興界圖書出版,2003：22-77.

[4]蔡蔚,朱閩,周青,等.前癃通膠囊治療良性前列腺增生癥36例臨床觀察[J].中醫藥導報,2008,14(6)：74-76.

[5]陳輝熔,鄧春華,丘少鵬,等.前列腺增生病人前列腺基質成分含量的變化[J].中華男科雜志,2001,7(6)：362-364.

[6]張亞強,盧建新,宋豎旗.中醫藥治療前列腺疾病的研究現狀[J].中國中西醫結合外科雜志,2010,16(3)：255-258.