冠心病發病與 C反應蛋白及其基因多態性的相關性研究

王彬

冠心病發病與 C反應蛋白及其基因多態性的相關性研究

王彬

目的 研究河南地區漢族人群血清C反應蛋白水平(CRP)及其1059G/C基因多態性與冠心病之間的關系。方法 采用全自動生化分析儀測定 286例冠狀動脈造影患者的血清 CRP水平,同時應用聚合酶鏈反應檢測 CRP的 1059G/C基因多態性,結合冠狀動脈造影結果進行分析。結果 冠心病組的自然對數轉換CRP(InCRP)水平顯著高于對照組(P＜0.05),以年齡、性別、吸煙、高血壓、體重指數和InCRP水平為自變量的Logistic回歸分析,InCRP水平(Ro=1.44,P＜0.01)和體重指數(OR= 1.01,P＜0.05)與冠心病獨立相關。1059G/C基因多態性等位基因和基因型的分布頻率符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=0.297,P＞0.05)。兩組的1059G/C基因型和等位基因的分布趨勢相同,差異無顯著性(P＞0.05)。C等位基因攜帶者的InCRP水平低于GG基因型(0.53±1.01比0.88±1.99 mg/l;P= 0.024),而冠狀動脈病變程度不受1059G/C基因多態性的影響(χ2=1.374,P＞0.05)。結論 血清CRP水平升高可能是河南地區漢族人冠心病的獨立危險因子;CRP水平可能受其 1059G/C基因多態性的影響。

冠心病;C反應蛋白;基因多態性

C反應蛋白(CRP)是一項敏感的反映機體炎癥狀態的指標。自從1994年采用Behring NA Latex CRP的生化定量測定提高了 CRP測定的靈敏度和精確度,大量前瞻性臨床研究表明 CRP水平的升高與心血管疾病尤其是冠心病發病危險度升高密切相關[1-6]。最近NH IJBI FHS研究[7]發現遺傳因素對血清GRP的水平發揮了35%～40%的作用,因此尋找CRP的基因標志日益受到人們的重視。2002年 5月美國 Zee等[8]在 1452例的 6.8年隨訪研究中發現,CRP基因第2外顯的1059位G-C突變與血清CRP水平降低有關,并證實CRP水平升高是冠心病的獨立危險因子之一。本研究旨在通過檢測 286例行冠狀動脈造影的患者血清高敏 CRP水平和1059G/C基因多態性,以了解河南地區漢族中該基因多態性頻率,并討其與CRP水平及冠心病之間的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇于我院住院行冠狀動脈造影的患者286例。應用Judkind法行冠狀動脈造影,由2名有經驗向醫師分析造影結果。冠狀動脈病變以血管直徑狹窄程度＞50%為陽性,嚴重程度分為正常冠狀動脈、1支病變、2支病變、3支病變。根據造影結果分為兩組:①冠心病組:共 188例,其中心絞痛 108例,陳舊性心肌梗死 45例和急性心肌梗死 35例;②對照組:冠狀動脈造影正常共 98例。所有研究對象均來自漢族人群,無血緣關系。

1.2 二研究方法

1.2.1 高血壓診斷標準 采用《19991WHO/ISH高血壓治療指南》的分類標準,收縮壓＞140mm Hg和(或)舒張壓＞90 mm Hg。體重指數(BMI)=體重/身高(kg/m2)。

1.2.2 血灣高敏CRP的測定 所有人選對象于冠狀動脈造影前一周內,采集清晨空腹靜脈血 2m l,應用免疫比濁法檢測血清CRP值(OLYMPUS AU 400 Analyzer)試劑由德國利得曼公司提供。

1.2.3 CRP的10599G/C基因型分析 抽取外周靜脈血5 m l枸櫞酸鈉抗凝;采用低滲溶血法獲得白細胞,以常規酚/氯仿抽提法提取DNA,TE溶解保存。應用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR)核苷酸分型技術檢測1059G/C基因多態性。根據 Cao等[9]提出的引物,序列如下:上游引物5'-GATCTGTGTGTGATCTGAGAAACCTCT-3'下游引物5'-GAGGTACCAGAGACAGAGACGTG-3'。PCR反應體系50μl,基因組DNA 100ng,10×PCR緩沖液5μl,200mmol/LdNTP, 1單位TaqDNA聚合酶。PCR反應條件:變性94℃5min;循環:94℃1 min,56℃1m in,72℃1 min,共35個循環;延伸72℃5m in。取純化后PCR產物 20μl,限制性內切酶III (Roche)酶切。55℃水浴4h。酶切片段經2%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色后通過UV凝膠成像系統判斷結果。

1.2.4 統計學處理 用SPSS 10.0軟件進行分析。基因型和等位基因頻率采用直接計。研究對象與Hardy-Weinberg平衡的符合程度,基因型和等位基因頻率的組間比較采用四格表 χ2檢驗和R×C列聯表χ2檢驗。計量資料采用均數士標準差（±s)表示,主要檢測指標均進行正態性檢驗,對于偏態分布的資料經對數轉換達到近似正態分布,再進行 t檢驗。以 P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組的一般臨床資科和血清CRP水平的比較(表1)由于血清CRP水平呈偏態分布,取其自然對數轉換為In-CRP,經Kolmogorov-Sm irnov檢驗近似正態分布(z=0.977,P =0.296)。兩組之間在年齡、性別、吸煙、高血壓和體重指數等方面差異均無顯著性(P＞0.05);但冠心病組的InCRP水平顯著高于對照組(P＜0.05)(表1)。以年齡、性別、吸、高血壓、體重指數和InCRP水平為自變的Logistic二回歸分析顯示,InCRP水平(OR=1.44,P＜0.01)和體重指數(OR= 1.01,P＜0.05)。與冠心病的危險性獨立相關。

表1 兩組一般臨床資料和血清lnCRP水平比較

2.2 兩組間1059G/C基因型和等位基因的分布 經PCR擴增片段大小為744bp,根據限制性內切酶MaeⅢ酶切的情況,表現為GG基因型(310 bp、233 bp、201 bp)、GC基因型(432bp、310 bp、233bp、201bp)和CC基因型(434 bp、310 bp)。在286例研究對象中GG、GC、CC基因型和G、C等位基因的分布頻率為83.7、14.2、2.0和91.4、8.6,符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=0.297,P＞0.05)。冠心病和對照組的1059G/C基因型和等位基因的分布趨勢相同,差異無顯著性(P＞0.05)(表2)。

注:DNA分子量標志;1:PCR產物;2,4:GC基因型;3,6,7:GG基因型;5:CC基因型

3.3 1059G/C基因多態性對CRP和冠狀動脈病變程度的影響 本研究中GG、GC和CC基因型的lnCRP水平分別為(0.88±0.99)、(0.54±1.04)、(0.33±0.53)lnmg/L,GG基因型的血清lnCRP水平(0.88±0.99)顯著高于GC+CC基因型(0.53±1.01)lnmg/L(P＜0.05);而冠狀動脈病變程度不受1059G/C基因多態性的影響(χ2=1.374,P＞0.05)(表3)。

表2 兩組間 1059G/C基因型和等位基因的頻率分布(例,%)

注:因CC基因型例數較少,與GC型合為一組;表3同此表

表3 1059G/C基因多態性與lnCRP和冠狀動脈病變程度的關系

3 討論

炎癥在動脈粥樣硬化性疾病的病程進展中起著顯著的作用。C反應蛋白(CRP)是炎癥急性相反應的標志物,正常情況下以微量形式存在于健康人的血清中。隨著 CRP的高靈敏度測定的進展使人們相信 CRP是一種微炎癥的指標,近年來的研究揭示高敏CRP水平與冠心病的發生過程直接相關,并能獨立預測近期的遠期心臟事件的發生,認為它是一個被低估了的未充分利用的指標[10]。MONICAAugsburg隊列研究[2]對 936名表面健康的中年男性隨訪 8年,結果表明高敏CRP水平與冠狀動脈疾病的發病率間存在顯著的正相關關系。即時對于認為發生心血管疾病危險度低的女性來說, Ridker等[3]的研究結果也證實高敏CRP測定是12種標志物中(包括炎癥、脂質和脂蛋白以及高半胱氨酸)心血管疾病最強的單變量預測因素。NSTACS研究[11]表明高敏CRP水平是非ST段抬高的急性冠狀動脈綜合征接受介入治療后近期和遠期病死率的獨立預測因子。

本研究在 286例進行擇期冠狀動脈造影檢查的人群中,冠心病組的血清高敏CRP水平顯著高于對照組,以Logistic回歸分析顯示CRP和體重指數與造影證實的冠心病獨立相關,表明高敏CRP水平升高的人群通過口服阿司匹林和他汀類藥物進行抗炎治療,可能會降低冠心病的發病危險度,內科醫師健康研究 (PHS)[4]和膽固醇及復發事件研究(CARE)[12]的結果也對這一觀點提供了有力的支持。

2000年加拿大Cao等[9]首次報道了CRP的第 2外顯子的1059位GC突變,由于血清CRP水平與冠心病的關系,提出 1059G/C基因多態性可能為冠心病的候選基因。我們運用PCR-RFLP技術檢測了286例研究對象的1059G/C基因多態性,發現河南地區漢族人中存在CRP的1059G/C基因多態性,1059C等位基因的頻率為8.6%,GG基因型的高敏CRP水平顯著高于GC+CC基因型,提示1059C等位基因與CRP基線水平降低相關,同時研究未發現 1059G/C基因多態性與冠心病發生和冠狀動脈病變嚴重程度的相關性,這與 Zee等[8]的研究結果一致。有學者認為,由于 1059G/C基因突變沒有改變氨基酸序列[9],它只是通過關聯其他未被發現的 CRP基因功能突變或附近的基因來影響 CRP表達的水平,因此,雖然未能證實 1059G/C基因多態性本身能預測冠心病的發生,但是,本研究發現遺傳因素可能影晌CRP的水平。CRP主要由白介素-6(IL-6)通過劑量依賴方式刺激肝細胞及活化巨噬細胞合成,Vickers等[13]研究發現IL-6的-174G/C基因多態性影響血清CRP水平表達,-174C等位基因與CRP基線水平高密切相關,并證實遺傳因素對CRP水平起了39%的作用。

目前有關 CRP致動脈粥樣硬化的機制尚不明確。近年研究表明 CRP可誘導單核細胞表達組織因子,激活凝血系統和補體系統,導致機體凝血、纖溶機制失衡,增加心血管事件的危險[10]。德國Hoffemeister等[14]的新近研究表明,在不穩定性心絞痛患者的急性期反應中,CRP水平高與致斑塊不穩定的未端補體系統的激活有關,從而為理論上解釋CRP對急性冠狀動脈綜合征的預測價值提供了依據。

我們的初步研究顯示高敏 CRP水平升高可能是河南地區漢族人冠心病發生的獨立危險因素,并可能受其 1059G/C基因多態性的影響。由于高敏CRP測定可能更好地預測心血管疾病的發病危險度,具有重大的臨床和公共衛生意義,因此尚需要進一步大規模臨床研究證實。

[1] HaidaiM,Javadi E,Sadeghi B,et al.Evaluation of C-reactive protein,a sensitive marker of inflammation,as a risk factor for stable coronary artery disease.Clin Biochem,2001,33:309-315.

[2] KoeningW,Sund M,Frohlich M,et al.C-reactive protein,a sensitive marker of inflammation,predicts future risk of coronary heart disease in initially healthymiddle-agedmen:results from the MONICA(Monitoring Trends and Determinants in Cardiovascular Disease)Augsburg Cohort Study,1984 to 1992.Circulation,1999,99: 237-242.

[3] Ridker PM,Hennekens CH,Buring JE,etal.C-reactive protein,and othermarkersof inflammation in the prediction ofcardiovascular disease in women.N Engl JMed,200,342:836-843.

[4] Ridker PM,Cushman M,Stampfer MJ,et al.Inflammation,aspirin, and the risk of cardiovascular disease in apparently healthymen.N Engl JMed,1997,336:973-979.

[5] Onat A,Sansoy V,Yildiring B,et al.C-reactive protein and coronary heart disease inwestern Turkey.Am JCardiol,2001,88:601-607.

[6] Backer JD,Mak R,Bacquer DD,et al.Parametetrs of inflammation and infection in a community based case-control study of coronary heart disease.Atherosclerosis,2002,160:457-463.

[7] Pankow JS,Folsom AR,Cushman M,et al.Familial and genetic determinants of systemic markers of inflammation:the NHLBI family hear study.Atherosclerosis,2001,154:681-689.

[8] Zee R,Ridker PM.Polymorphism in the human C-reactive protein (CRP)gene,plasma concentrations of CRP,and the risk of future arterial thrombosis.Atherosclerosis,2002,162:217-219.

[9] Cao H,Hegele RA.Human C-reactive protein(CRP)gene 1059G/C polymorphism.JHum Genet,2000,55:100-101.

[10] Ferranti SD,RifaiN.C-reactiveprotein and cardiovascular disease: a review of risk predoction and intervention.Clin Chim Acta,2002, 317:1-15.

[11] Mueller C,Buettner HJ,Hodgson JM,et al.inflammation and longterm mortaliy after non-ST elevation acute coronary syndrome treated with averyearly invasivestrategy in 1042consecutive patients. Circulation,2002,105:1412-1415.

[12] Ridker PM,Rifai N,Pfiffer MA,et al.Long-term effects of provastation on plasma concentration of C-reactive protein.Cholesterol and Recurrent Events(CARE)Investigators.Circulation,1999, 100:230-235.

[13] Vickers MA,Green FR,Terry C,etal.Genotype at a promoter polymorphism of the interleukin-6gene isassociated with baseline levels of plasma C-reactive protein.Cardiovasc Res,2002,53: 1029-1034.

[14] Hoffemeister HM,Ehlres R,Buttcher E,et al.Comparison of Creative protein and terminal complement complex in patients with unstable angina pectorisversus stable angina pectoris.Am JCardiol, 2002,89:909-912.

Plasma C-reactive protein leveland the 1059G/C polymorphism of CRP in patientswith coronary artery disease

WANGBin.

Objective To investigate the relationship between plasma levelsof ultra-sensitive C-reactive protein(CRP)or1059G/C polymorphism and angiographically documented coronary artery disease(CHD)in Chinese.Methods Plasma level ofultra-sensitive CRPwas determined by Immunoturbidimetric analyzetr in288 patientsundergoing selective coronary angiography,and the 1059G/C polymorphism of CRP gene was screened by PCR.Results CHDgroup showed significantly higherp lasma levelof in CRP than controlgroup(P＜0.05) in CRP(OR=1.44,P＜0.01)and body mass index(OR=1.01,P＜0.05)were risk factors associated with CHD on logistic regression analysis.The allele and genotype frequencies were consistentwith that predicter by Hardy-Weinberg equilibrium in the present study population(χ2=0.297,P＞0.05).There was no significant difference between CHD group and control group for1059G/C polymorphism(P＞0.05).Plasma in CRP level wassignificantly lower among carriers of 1059C Allele as compared with non-carriers GG genotype(0.53± 1.01vs 0.88±1.99 mg/l;P=0.024)There was also no significant difference in the number of stenotic vessels by 1059G/C polymorphism(χ2=1.374,P＞0.05).Conclusion Baseline plasmaultra-sensitive Creactive proteinmaybe an independent risk factor of CHD and the levelmay be influenced by 1059G/C polymorphism of the CRP gene in Chinese.

Coronary artery disease;C-reactive protein;Gene polymorphism

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