益氣補腎中藥對自然流產模型小鼠CD28分子表達的影響

陳雪君 浙江省臺州醫院 臺州 317000

葉 平 浙江省中醫院

胡藍雅文 黃丹云 丁鍵紅 浙江中醫藥大學

益氣補腎中藥對自然流產模型小鼠CD28分子表達的影響

陳雪君 浙江省臺州醫院 臺州 317000

葉 平 浙江省中醫院

胡藍雅文 黃丹云 丁鍵紅 浙江中醫藥大學

目的：觀察益氣補腎中藥對小鼠母胎免疫的調節作用。方法：以CBA雌鼠×DBA/2雄鼠建立小鼠自然流產模型，將20只CBA孕鼠隨機分成四組，每組5只?？瞻讓φ战M（NS組）予生理鹽水灌胃，西藥組予環孢菌素A（CsA）灌胃，中藥組予益氣補腎中藥灌胃，中西結合組予中藥+CsA灌胃。妊娠14天處死孕鼠，取脾臟與母胎界面組織，用流式細胞分析術（FCM）分析各組孕鼠CD28分子的表達情況。結果：CD28分子在脾臟表達趨勢從高到低依次為：生理鹽水組、西藥組、中西結合組、中藥組，各治療組CD28分子表達均低于NS組（P＜0.05）；CD28分子在母胎界面上表達趨勢從高到低依次為：生理鹽水組、中藥組、西藥組、中西結合組，中西結合組CD28分子表達低于NS組、西藥組和中藥組（P＜0.05）；中藥組、西藥組CD28分子表達均低于NS組（P＜0.05）。結論：益氣補腎中藥對自然流產模型小鼠有下調CD28分子表達的作用趨勢。

小鼠 自然流產模型 CD28 益氣補腎 中藥

近年來，我們臨床選取補中益氣湯加減治療反復自然流產（SA），取得滿意療效。關于其在母胎免疫中是否具有調節CD28分子表達的作用，目前國內尚未見報道。本研究觀察益氣補腎中藥應用于小鼠自然流產模型小鼠CD28分子的表達影響，探討益氣補腎中藥對母胎免疫調節的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動 物 8～10周齡、性成熟、體重20g左右的雌性CBA小鼠40只，雄性DBA/2小鼠20只。由浙江中醫大學動物實驗中心提供，動物使用許可證號：SCXK（滬）2008-0016。實驗小鼠飼養在浙江中醫大學動物實驗中心清潔級動物房內，環境溫度：（25±1）℃，相對濕度50%～70%，換風次數15～20次/h，光照150～200Lx，12h明暗交替，噪音＜50dB,自由攝食與飲水。實驗前，先不加任何干預，將小鼠飼養1周，使其很好地適應環境。

1.2 藥 品 益氣補腎中藥煎劑：黃芪36g，黨參12g，當歸6g，陳皮、升麻、柴胡各12g，白術18g，菟絲子30g，加水濃煎至每毫升湯劑含2g生藥。中藥飲片購自浙江省中醫院中藥房，浙江中醫藥大學中藥實驗室煎制。密封保存于消毒容器中，置于4℃冰箱內保存備用。

1.3 主要試劑 生理鹽水、環孢菌素A（新山地明，CsA）購自浙江省中醫院中藥房。磷酸鹽緩沖液(PBS溶液)、RPMI-1640培養液（吉諾生物醫藥技術有限公司生產）；小鼠淋巴細胞分離液(天津TBD灝洋生物制品科技有限責任公司生產)；FITC Conjugated Anti-mouse CD3e、PE Conjugated Anti-mouse CD28、PE ConjugatedAnti-mouseCD152（CTLA-4）、PE Conjugated Armenian Hamster IgG Isotype Control、PE Conjugated Golden Syrian Hamster IgG Isotype Control（均由美國eBioscience公司生產）。

1.4 主要設備與儀器 微量移液槍（0.1-5000μL，德國 Eppendorf公司）；低速自動平衡離心機（LDZ5-2型，北京京立離心機有限公司）；漩渦混合器（XW-80A型，上海醫科大學儀器廠）；血球計數板（XB-K-25型，上海求精生化試劑儀器有限公司）；光學顯微鏡（CX31RTSF型，日本OLYMPUS公司）；流式細胞儀（Facs Calibur基本型，美國BD公司）。

2 實驗方法

2.1 模型制備 將20只雌性CBA小鼠編號、稱重，根據隨機數字表隨機分為生理鹽水對照組（NS組）、西藥組、中藥組、中西結合組，每組各5只。與雄性DBA/2小鼠以2：1合籠交配，造自然流產模型。合籠后，每天觀察雌鼠陰栓，見陰栓日為妊娠第0天。

2.2 給藥途徑與劑量 NS組自妊娠第0天開始，予生理鹽水10ml/kg灌胃，1天1次。西藥組：妊娠第4天（著床期）予環孢菌素A10mg/kg灌胃1次。中藥組：自妊娠第0天開始，予益氣補腎中藥27g/kg灌胃，1天1次。中西結合組：自妊娠第0天開始，予益氣補腎中藥27g/kg灌胃，1天1次，并在妊娠第4天予環孢菌素A10mg/kg灌胃1次。

2.3 觀察指標與檢測方法

2.3.1 標本采集 妊娠第14天處死小鼠，75%乙醇消毒后，用眼科剪剪開小鼠腹部皮膚肌肉、腹膜，鈍性分離脾臟。鈍性+銳性分離子宮，用鑷子撕開子宮，除去胚胎及胎盤，留下子宮及蛻膜組織，即為母胎界面組織。

2.3.2 制備脾臟單細胞懸液 將取出的脾臟用PBS溶液洗一次后，置于裝有2mL RPMI-1640培養液的平皿中，用1mL注射器抽取RPMI-1640培養液沖打脾臟，至脾臟呈半透明狀，過200目網篩，制成細胞懸液。用移液槍將細胞懸液加至同體積的小鼠淋巴細胞分離液上，注意保持液體分層清晰。以2000r/min的轉速離心15min后，移液槍吸取云絮層，置入裝有4mL RPMI-1640培養液的試管中。搖勻，再以1500r/min的轉速離心10min后，棄去上清液。洗滌：加入1mL的PBS溶液，反復沖打，再以1500r/min的轉速離心10min后，棄去上清液。重復洗滌2次后，再加入0.5mL PBS溶液，反復沖打，制成單細胞懸液。

2.3.3 制備母胎界面組織單細胞懸液 將取出的母胎界面組織用PBS溶液洗一次后，置于裝有3mL RPMI-1640培養液的平皿中，剪碎，研磨，過300目濾網，制成細胞懸液。余步驟同脾臟單細胞懸液的制備。

2.3.4 計數細胞 將單細胞懸液添加到血球計數板上，顯微鏡下計數細胞，調節濃度至1×107/mL。

2.3.5 細胞染色和流式細胞分析術（FCM）分析 取4支試管，編號為：實驗管（a、b）、對照管（a、b）。a試管加入100μL脾臟單細胞懸液，b試管加入100μL母胎界面組織單細胞懸液，按標準化法標記細胞，見表1。

表1 各管所加單抗與劑量

加抗后用漩渦混合器渦旋振蕩，避光孵育30min后，再每管加入0.5mL PBS溶液洗滌離心一次，棄上清液，然后將細胞重懸于200μL PBS液中，即刻上機，用Cell Quest軟件獲取細胞,每份樣本檢測1× 105個細胞,結果以CD3+CD28＋T細胞占CD3＋T細胞的百分比進行計算。測試完畢后用Cell Quest Pro軟件分析數據。

2.4 統計學方法 實驗結果用SPSS13.0統計學軟件包處理分析，實驗數據以（±s）表示，進行t檢驗；組間差異比較采用one-way ANOVA檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 一般情況 各組小鼠精神狀態、活動情況、飲食、二便、毛發光澤度等情況均無殊，未見陰道口流血現象。

3.2 各組間CD28分子的表達差異 實驗結果以CD3+CD28＋T細胞占CD3＋T細胞的百分比計算。妊娠14天各組CD28分子表達情況見表2。

表2 妊娠14天各組CD28分子的表達情況（ x±s ） %

4 討 論

T輔助（Th）細胞的功能性分化是近年來免疫學研究的熱點之一，Th細胞根據其分化后產生Th1/Th2兩類不同的T輔助細胞1（Th1）、T輔助細胞2（Th2）細胞因子平衡與妊娠結局關系密切。Th1、Th2細胞有著不同的功能。Th1型細胞因子具有胚胎毒作用，妨礙早期胚胎的發育，引起妊娠丟失；相反Th2型細胞因子具有免疫營養作用，對正常妊娠的維持起保護作用。正常妊娠是以母體向Th2型細胞因子偏移的體液免疫應答；而病理性妊娠如不明原因的反復自然流產則以向Th1型細胞因子偏移的細胞免疫應答[1]。

T細胞的活化除了需要抗原刺激外，還需第二信號的參與。當第一信號和第二信號同時存在時，T細胞克隆活化并增殖，產生免疫應答；當僅有第一信號而缺乏第二信號時，則可誘導T細胞產生抗原特異性無反應(anergy)，被認為是造成抗原特異性免疫耐受的重要機制[2]。

第二信號的傳遞主要由協同刺激分子完成，CD28分子是共刺激分子B7分子的受體。CD28主要與B7-1（CD80）結合，啟動T細胞活化途徑。CD28與T細胞受體 (TCR)、CD3協同作用,產生雙刺激信號以激活T淋巴細胞，誘導Th細胞向Th1分化[3]。

中醫認為，自然流產的病因病機主要有母體沖任損傷和胎元不健兩個方面。其中又以母體脾腎兩虛最為關鍵。腎主先天，精藏于腎，而胞脈系于腎，胎元是否鞏固主要責之腎精、腎氣是否充實；胎孕已成后不僅需先天生殖之精的滋養和腎氣的鞏固，還有賴于后天水谷之精的充養。脾為后天之本，脾虛運化水谷精微不足，必致氣血虧虛，胎失所養，導致胎元不固而損墮。因此，治療上應脾腎兼顧。

本實驗所用的益氣補腎方為導師葉平副教授根據臨床經驗，結合文獻資料研究，由經方化裁而來。方中重用黃芪、菟絲子，兩者共為君藥。黃芪味甘微溫，入脾肺經，補中益氣，升陽固表；菟絲子辛、甘、平，入腎、肝、脾經，具有補腎益精、養肝明目、安胎之效。黨參、白術補氣健脾為臣。當歸養血和營，協黨參、黃芪以補氣養血；陳皮理氣和胃，使諸藥補而不滯，共為佐藥。并以少量升麻、柴胡升陽舉陷，協助黃芪以升提下陷之中氣，為佐使藥。全方以益氣補腎為主，兼顧健脾養血，達安胎之效。藥理研究證實[4]，益氣補腎中藥具有免疫調節作用，有利于母胎界面免疫耐受狀態的維持，是臨床保胎治療的常用藥物。

實驗結果表明，益氣補腎中藥在妊娠14天，對于自然流產模型小鼠均有下調CD28分子在局部表達的作用（P＜0.05），有下調CD28分子在全身表達的作用趨勢（P＞0.05）。推測益氣補腎中藥可能通過下調CD28分子表達，減少Th細胞向Th1分化，維持Th1/Th2平衡，從而有利于妊娠狀態的維持，降低自然流產發生率。這在一定意義上，可為臨床上益氣補腎中藥治療SA提供理論依據。實驗結果顯示，各組間觀察指標差異雖有一定的趨勢，但無統計學意義（P＞0.05），有待于大樣本的實驗進一步研究。

［1］Wilczynski Jacek R.Immunological analogy between allograft rejection,recurrent aborti-on and pre-eclampsia the same basic mechanism［J］.Human Immunology，2006,67（7）: 492-511.

［2］Harding FA,McArthur JG,Gross JA,et al.CD28-mediated signaling costimulates murine T cells and prevents induction of anergy in T-cell clones［J］.Nature,1992, 356:607-609.

［3］金莉萍，李大金，王明雁，等.孕早期干預協同刺激信號誘導自然流產模型孕鼠外周母-胎免疫耐受［J］.中華婦產科雜志,2004（4）:234-237.

［4］武美麗，柳肅芬.反復自然流產的免疫學研究進展與展望［J］.中國婦幼保健，2007，22:1707-1708.

Effects of Traditional Chinese Medicine with function of invigorating Qi and tonifying kidney on CD28 in

Abortion-Prone Mice

CHEN Xuejun,YE Ping,HULAN Yawen,et al．Taizhou Hospital of Zhejiang,Taizhou(317000),China

Abstrct Objective:To study the effects oftraditional Chinese medicine(TCM)with function ofinvigorating Qi and tonifying kidney on the expression of CD28 at spleen and maternal-fetal interface in abortion-prone mice during pregnancy. Methods:CBA female mice were mated to DBA/2 male mice to establish an abortion-prone model.The female mice were divided randomly into 4 groups(5 in each):control group(NS group):drenched normal saline everyday since the first day of gestation;western medicine(WM)group(cyclosporine group):drenched cyclosporine solution once on the 4thday of gestation;TCM group:drenched the TCM decoction with the function of invigorating Qi and tonifying kidney everyday since the first dayofgestation;and TCM-WM(TCMdecoction+cyclosporine)group:drenched the TCMdecoction everyday since the first day and cyclosporine solution on the 4thday of gestation.On the 14thday of gestation,the mice were killed in batches and their spleen and maternal-fetal interface tissues were made into single cell suspension to detect the expression of CD28 by flow cytometry (FCM).Results:The expression of CD28 in spleen tissues in NS group,cyclosporine group,TCM-WMgroup,and TCMgroup was fromhigh tolowin order and it was significantlylower in the latter 3 groups as compared with the NS group(P＜0.05).The expression ofCD28 at maternal-fetal interface in the NS,TCM, cyclosporine,and TCM-WM group was from high to low in order,with a significant difference between the TCM-WM group and the NS,TCMand cyclosporine groups(P＜0.05)and between the TCMand WMgroups and the NS group(P＜0.05).Conclusion:TCM with function of invigorating Qi and tonifying kidney may reduce the expression of CD28 in abortion-prone mice.

mice spontaneous abortion CD28 invigoratingQi and tonifyingkidney TCM

2010-08-02