心理應激聯合腹腔注射卵清蛋白致大鼠內臟高敏感的實驗研究

石君杰 浙江醫學高等專科學校 杭州310053

王海云 李新偉 浙江省立同德醫院

李佳俊 浙江省紹興市東湖鎮人民醫院

心理應激聯合腹腔注射卵清蛋白致大鼠內臟高敏感的實驗研究

石君杰 浙江醫學高等?？茖W校 杭州310053

王海云 李新偉 浙江省立同德醫院

李佳俊 浙江省紹興市東湖鎮人民醫院

目的:探討建立腹瀉型腸易激綜合征(D-IBS)內臟高敏感模型的方法。方法:采用心理應激聯合腹腔注射卵清蛋白法誘導IBS大鼠模型，檢測其腸道運動(結腸排便時間、排便顆粒)、內臟感覺(腹壁收縮反射、腹壁肌電活動)及結腸黏膜組織學改變。結果:與正常對照組比較，心理應激聯合腹腔注射卵清蛋白法可誘導大鼠腸道動力紊亂，內臟敏感性增高(P＜0.05，P＜0.01)，組織學檢查無明顯炎癥性表現。結論:心理應激聯合腹腔注射卵清蛋白法建立IBS模型，符合其動力、感覺及組織學特征，可用于IBS的實驗研究。

大鼠 腸易激綜合征 內臟高敏感性 腹瀉型

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)是以腹痛或腹部不適伴大便異常為特征的功能性腸病［1］，其發病機制主要與胃腸動力學異常、內臟感覺過敏、腸道感染和心理等因素有關。目前，IBS的動物模型多是根據以上的一個因素或一種機制建立。本文在前期工作的基礎上，采用心理應激聯合腹腔注射卵清蛋白法建立IBS模型并對其進行評價。現報道如下。

1 實驗材料

1.1 動 物 清潔級SD大鼠30只，雌雄各半，體質量(180±10)g，由浙江中醫藥大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號:SYXK(浙)2008-0115。適應環境1周后用于實驗，飼養和實驗操作過程均在標準二級大鼠實驗室進行。

1.2 試劑與儀器 雞卵清蛋白，購自上海歐韋達生物科技有限公司;8F導尿管，導管直徑2mm，球囊最大容量3mL，最大直徑2cm，用作直腸內球囊擴張導管(購自浙江華東醫藥股份有限公司醫療器械分公司);olympus-CH-2光學顯微鏡(日本歐林巴斯光學工業株氏會社生產)，生物機能信號采集分析系統(上海中勝科教設備有限公司生產)。

2 實驗方法

2.1 造 模 心理應激施以慢性束縛+夾尾刺激［2］。大鼠每5只同籠，用裹有海綿的夾子夾大鼠尾巴近端1/3處，注意不損傷皮膚，使其激怒，尋釁與其他大鼠撕打，從而激怒全籠大鼠打斗，刺激時間持續30min。夾尾刺激結束1h后，予30g/L戊巴比妥鈉(1mL/kg)麻醉，用寬布帶束縛前肩、前上肢及胸部，限制其搔抓頭面部，但不控制其活動。自大鼠清醒后開始計時，束縛時間為2h。腹腔注射卵清蛋白法以雞卵清蛋白30mg加入濃度為10mg/mL的氫氧化鋁凝膠1mL中，充分混勻后腹腔注射［3］。

2.2 分組及干預 實驗動物按隨機數字表法隨機分為IBS1組、IBS2組和正常對照組，每組10只。IBS1組:實驗第1天，心理應激+腹腔注射卵清蛋白;實驗第2天至第14天，僅施以心理應激，每天1次。IBS2組:實驗第1天，心理應激+腹腔注射1mL 0.85%氯化鈉，其余方法同IBS1組相同。正常對照組大鼠不予任何刺激。

2.3 指標檢測

2.3.1 結腸動力 實驗結束后第2天，大鼠禁食，予30g/L戊巴比妥鈉(1mL/kg)麻醉，取直徑3mm玻璃小球放入距肛門3cm直腸內。大鼠蘇醒后迅速移至籠內喂食飲水，籠內墊清潔濾紙。自大鼠清醒后開始計時，束縛時間2h。觀察束縛2h內排便的糞點數和直腸內玻璃小球排出時間。

2.3.2 AWR行為評分 實驗結束后第2天，大鼠麻醉下，將石蠟油潤滑后的導尿管經肛門插入，球囊末端距離肛門1cm，用膠布把導管和大鼠尾巴根部纏在一起，固定氣囊。蘇醒后放在特制的透明塑料桶籠中，只能前后運動，不能轉身。30min適應期后用球囊進行直腸擴張(colorectal distention，CRD)。每只大鼠給予直腸內球囊擴張3次，容量分別為1.0、1.5、2.0mL，每次擴張持續1min，間隔5min(以防腸道缺血)。由另一獨立的觀察者進行腹部收縮反射(abdominal withdrawal refler，AWR)評估，評估數據取均值。AWR行為評分參照文獻標準［4］。0分:在給予CRD刺激時大鼠情緒基本穩定;1分:在給予CRD刺激時，變得不穩定，偶爾扭動頭部;2分:大鼠腹背部肌肉輕微收縮但腹部未抬離地面;3分:大鼠腹背部肌肉較強收縮并把腹部抬離地面;4分:大鼠腹部肌肉強烈收縮，背部呈弓形，并把腹部、會陰部抬離地面。

2.3.3 腹壁肌電活動 實驗結束后第2天，大鼠麻醉下，將雙極電極縫合到腹股溝韌帶上方、距中線1.5cm的一側腹外斜肌上，電極的游離端經皮下隧道引至頸背部以玻璃管保護后固定于皮膚，將電極導線的兩端連接生物機能信號采集分析系統，于不同擴張容量(1.0、1.5、2.0mL)下行CRD，每次擴張持續5min，記錄5min內肌電活動。肌電活動增高超過基線水平100μV以上認為是一次有意義的腹部收縮活動。

2.3.4 結腸黏膜病理 指標檢測結束后，各組隨機取5只大鼠處死，剖取乙狀結腸0.5cm，10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，蘇木精-伊紅染色，光學顯微鏡下觀察大鼠結腸黏膜病理組織學改變。

2.4 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件，計量數據以(±s)表示，組間差異比較采用單因素方差分析。

3 實驗結果

3.1 各組大鼠結腸動力比較 與正常組比較，IBS1

組、IBS2組大鼠結腸轉運加速，排便量增多，直腸內玻璃小球排出時間縮短(P＜0.05，P＜0.01)，見表1。

表1 各組大鼠結腸動力比較(±s)

表1 各組大鼠結腸動力比較(±s)

注:與正常組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

n//min IBS1組 10 6.46±1.25* 15.75±2.60組別 只 排便顆粒數 排便時間＊＊10 3.25±1.10 28.65±2.07 IBS2組 10 6.10±1.59* 17.94±2.58＊＊正常組

3.2 各組大鼠AWR評分比較 與正常組比較，IBS1組、IBS2組大鼠在球囊結直腸擴張1.0、1.5、2.0mL不同容量下腹部收縮反射評分明顯升高(P＜0.05，P＜0.01)，見表2。

表2 各組大鼠AWR評分比較(±s) 分

表2 各組大鼠AWR評分比較(±s) 分

注:與正常組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

1.0mL 1.5mL 2.0mL IBS1組 10 1.60±0.50＊＊ 2.80±0.70＊＊ 3.60±0.70組別 n/只*組 10 1.50±0.40＊＊ 2.60±0.60＊＊ 3.40±0.50* 10 0.80±0.50 1.60±0.70 2.50±0.60 IBS2正常組

3.3 各組大鼠腹壁肌電活動水平比較 與正常組比較，IBS1組、IBS2組大鼠在球囊結直腸擴張1.0、1.5、2.0mL擴張容量時腹壁肌電活動明顯升高，差異有統計學意義(P＜0.01)，見表3。

表3 各組大鼠5min腹壁肌電活動次數比較(±s) 次/min

表3 各組大鼠5min腹壁肌電活動次數比較(±s) 次/min

注:與正常組比較，＊＊P＜0.01

1.0mL 1.5mL 2.0mL IBS1組 10 6.42±0.86＊＊ 12.94±1.30＊＊ 22.96±2.85組別 n/只＊＊IBS2組 10 6.17±0.73＊＊ 12.05±1.59＊＊ 20.64±2.47＊＊正常組10 3.30±0.85 8.25±1.64 12.83±1.90

3.4 各組大鼠結腸黏膜組織學改變 各組大鼠結腸黏膜組織結構完整，均無充血、水腫、潰瘍，光鏡觀察無彌漫性炎癥細胞浸潤等組織學改變。

4 討論

IBS是多種因素引起的疾病，發病機制復雜。既往研究建立動物模型的造模方法中，動物腸管離體實驗占20%，化學刺激造模占20%，心理應激造模占20%，藥物導瀉造模占13%，復合方法造模占25%［5］。

應激法建立IBS模型的理論依據是心理因素與IBS發病密切相關，應激可產生IBS樣癥狀，相當一部分患者，癥狀的出現與應激經歷有關，新近出現的應激事件往往可以加重腸道癥狀。Williams等［6］研究證明，束縛應激可以改變大鼠小腸和直腸傳輸時間，增加排便次數，是一種較輕微的對腸黏膜輕微的、非潰瘍形成的刺激。Mayer等［7］報道，應激對動物的感覺和動力會存在不同程度的影響。呂紅等［8］研究發現束縛應激除可用于IBS動力研究外，還可進行IBS內臟敏感性的研究。

夾尾刺激是一種常用的精神刺激，研究表明，經常受慢性精神刺激的大鼠腸黏膜上皮細胞顯著增加［9］。應激所致IBS模型，雖能部分模擬人類IBS的某些特征，但這些人為的誘發因素或條件刺激與IBS發病的自然因素相距甚遠，此模型有一定的局限性。以外周為靶點的刺激多采用病原體感染或化學刺激物灌腸等，但這些機械或化學性物質損傷造成IBS內臟感覺異常并不符合生理過程。而雞卵清蛋白在各種腸道病理損傷狀態下均可能侵入腸道，采用腹腔注射卵清蛋白，可誘發免疫過程，通過免疫機制造成內臟敏感性增高。

鑒于IBS病因的復雜性、病機的多重性，建立多成分綜合性動物模型更符合IBS的實際情況。本實驗結果表明，心理應激聯合腹腔注射卵清蛋白法誘導IBS模型大鼠結腸黏膜病理學觀察無明顯組織學改變，結腸動力、內臟敏感性明顯增加(P＜0.01)，符合IBS臨床特點;同時多因素作用模型更好的模擬了IBS的多因素發病機制，反映了心理應激和免疫在IBS發病中的作用，可從不同角度觀察IBS藥物作用療效和機制，具有一定的優勢和說服力，可以作為IBS研究的有效模型。

［1］李延青，楊云生，陳建.腸易激綜合征［M］.北京:中國醫藥科技出版社，2005:128-136.

［2］石君杰，戴玉英，王海云，等.慢性束縛及夾尾刺激致大鼠腸易激綜合征模型的建立及其內臟敏感性評價［J］.中國中西醫結合消化雜志，2008，16(2):87-90.

［3］李兆申，詹麗杏，鄒多武，等.腹腔注射卵清白蛋白致大鼠內臟高敏感性的研究［J］.第二軍醫大學學報，2003，24(2):127-129.

［4］Ness TJ，Gebhart GF.Colorectal distension as a noxious visceral stimulus:physiologic and pharm acologic characterization of pseudaffective refoexes in the rat［J］.Brain Res，1988，45(6):153-169.

［5］李熠萌，蔡淦.腹瀉型腸易激綜合征的中醫實驗研究進展［J］.世界科學技術—中醫藥現代化，2009，11(4):541-544.

［6］Williams CL，Villar GR，Peterson JM，et al.Stessinduced changes in intestinal transit in the rats:a model for irritable bowel syndrome［J］.Gsatroenterology，1988，94(3):611-621.

［7］Mayer EA，Bradesi S，Chang L，et al.Function GI disorders: from animal to drug development［J］.Gut，2008，57:384-404.

［8］呂紅，王偉岸，錢家鳴.傳統束縛應激動物模型內臟感覺的新評價［J］.胃腸病學和肝病學雜志，2005，14(2):111-113.

［9］吳偉康，徐志偉.中西醫結合病理生理學［M］.北京:科學出版社，2003:316-317.

Establishment of A Rat Model of Visceral Hypersensitivity Induced by Stress and Intraperitoneal Injection of Ovalbumin

SHI Junjie，WANG Haiyun，LI Xinwei，et al．Zhejiang Medical College，Hangzhou(310053)，China

Objective:To establish a rat model of visceral hypersensitivity in diarrhea-type irritable bowel syndrome(D-IBS)by stress induction and intraperitoneal injection of ovalbumin.MethodsStress and ovalbumin were given to Sprague Dawley rats.After modeling，the colon transit was observed，the rectal distention was performed，the thresholds of abdominal withdrawal reflex were measured，and the abdominal wall myoelectrical activity was recorded.Histology in the colon mucosa was examined.ResultsCompared to the control group，the movement of the colon was abnormal，and the thresholds of abdominal withdrawal reflex(P＜0.05)，and the myoelectrical activity(P＜0.01)were increased in the IBS group.No obvious inflammatory change was noted in histological examination.ConclusionStress combined with intraperitoneal injection of ovalbumin can successfully induce D-IBS in rats.This model has the characteristics of abnormal intestinal transit，hypersensitivity，and histology of IBS，which is suitable for experimental studies.

rats irritable bowel syndrome visceral hypersensitivity diarrhea type

浙江省中醫藥科技計劃項目(No.2008YB006)

2011-01-17

·病例報道·