TGF-β和EGF對(duì)人分泌中期子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞MMP-9的影響

程 靜 黃朝霞 池海紅 呂杰強(qiáng) 溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖中心 溫州325000

TGF-β和EGF對(duì)人分泌中期子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞MMP-9的影響

程 靜 黃朝霞 池海紅 呂杰強(qiáng) 溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖中心 溫州325000

目的:觀察轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)和表皮生長(zhǎng)因子(EGF)對(duì)人分泌中期子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(ESC)基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的影響。方法:體外培養(yǎng)ESC，分離、純化后的ESC以1 ×105個(gè)/孔接種于96孔板，加入含10%胎牛血清的 DMEM/F12培養(yǎng)液。24h后換無(wú)血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，每孔200μL，分別加入TGF-β和EGF，終濃度均為2.5、5.0和10.0ng/mL，培養(yǎng)48h后通過(guò)ELISA法測(cè)培養(yǎng)液中MMP-9的含量。結(jié)果:與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組隨著TGF-β濃度的增加，ESC分泌的MMP-9明顯下降(P＜0.05，P＜0.01);而隨著EGF濃度的增加，ESC分泌的MMP-9則顯著上升(P＜0.05，P＜0.01)，且二者的變化具有劑量依賴性。結(jié)論:TGF-β和EGF可能通過(guò)調(diào)節(jié)人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞MMP-9，而參與胚胎植入過(guò)程。

子宮內(nèi)膜細(xì)胞 分泌中期 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β 表皮生長(zhǎng)因子 基質(zhì)金屬蛋白酶-9

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是具有許多共同生化特性、可降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracell matrix，ECM)的一類Zn2+依賴性蛋白水解酶，廣泛分布在人體各種組織和器官內(nèi)。很多研究表明，MMP-9是MMPs家族中較重要的一種蛋白酶，其在各期子宮內(nèi)膜均有表達(dá)，對(duì)于胚泡著床、胚胎植入以及胎盤(pán)形成以及子宮和胎兒血管系統(tǒng)的建立過(guò)程均發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。本研究通過(guò)體外培養(yǎng)的人分泌期子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(endometrial stromal cells，ESC)中分別加入不同濃度的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)和表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)，檢測(cè)ESC分泌的MMP-9含量變化，探討TGF-β和EGF對(duì)胚胎植入過(guò)程的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 標(biāo)本來(lái)源 取自因不孕癥診斷性刮宮術(shù)患者的子宮內(nèi)膜(病理證實(shí)為分泌期)，患者年齡30～45歲，術(shù)前3個(gè)月內(nèi)未使用性激素類藥物，無(wú)其他婦科疾患史及內(nèi)分泌、免疫和代謝性疾病。術(shù)后在無(wú)菌條件下將刮取的子宮內(nèi)膜組織放入冷D-Hanks液中立即進(jìn)行子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(ESC)分離培養(yǎng)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)論證批準(zhǔn)，患者知情同意。

1.2 主要試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、Ⅱ型膠原酶，TGF-β、EGF(Sigma公司產(chǎn)品);細(xì)胞培養(yǎng)瓶、6孔板、96孔板(Corning公司產(chǎn)品);鼠抗人波形蛋白單克隆抗體、鼠抗人角蛋白單克隆抗體(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司);人基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP -9)ELISA試劑盒(上海滬峰化工有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 ESC分離與純化 所獲子宮內(nèi)膜組織用PBS洗滌2～3次，用眼科剪將其剪成0.5～1mm3碎塊;加入2倍組織體積的膠原酶Ⅰ(0.2%)，37℃水浴箱震蕩消化30min;2%FBS細(xì)胞培養(yǎng)液漂洗2～3次，加入2倍組織體積的消化酶Ⅱ(0.1%膠原酶 +0.01% DNase)混合消化液，37℃水浴箱震蕩消化30min;100目篩網(wǎng)過(guò)篩去除大塊未消化組織，2%FBS細(xì)胞培養(yǎng)液漂洗2～3次，離心(800r/min×10min)去除上清液;沉淀部分用2%FBS細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮后，經(jīng)35μm的細(xì)胞篩過(guò)濾，收集通過(guò)濾網(wǎng)的細(xì)胞濾過(guò)液吸到離心管中，離心500r/min，5min，棄上清，將沉淀用DHanks液進(jìn)行沖洗，再進(jìn)行離心，反復(fù)進(jìn)行2次;加入10%FBS DMEM/F12培養(yǎng)液，置37℃、5%CO2恒溫孵育箱中培養(yǎng)，隔日換液，以除去未貼壁的間質(zhì)細(xì)胞和血細(xì)胞。

2.2 ESC鑒定 分離、純化的ESC傳代1次，將細(xì)胞以1×106個(gè)/孔接種于6孔板，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，放入蓋玻片，上述培養(yǎng)條件培養(yǎng)間質(zhì)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞在上面長(zhǎng)滿后，取出蓋玻片，以D-Hanks液反復(fù)洗滌3次，用冷丙酮固定10min，晾干，4℃冰箱過(guò)夜。將單克隆抗體角蛋白和波形蛋白按1∶75稀釋，用ABC法染色，以鑒定細(xì)胞類型，凡是胞質(zhì)被染成棕黃色的為陽(yáng)性細(xì)胞。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組 分離純化的ESC傳代1次，將細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于96孔板，加入含10%胎牛血清的 DMEM/F12培養(yǎng)液。24h后換無(wú)血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，每孔200μL，分別加入TGF-β和EGF，使其終濃度均分別為2.5、5.0、10.0ng/mL，每個(gè)濃度種5個(gè)孔;另設(shè)一列對(duì)照組，僅加入10% DMEM/F12培養(yǎng)液200μL。5%CO237℃培養(yǎng)48h后收集培養(yǎng)液，離心取上清，-20℃保存待測(cè)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)1次。

2.4 ELISA法檢測(cè) 檢測(cè)不同濃度TGF-β和EGF對(duì)ESC分泌的MMP-9影響，按試劑盒說(shuō)明操作。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(ESC)形態(tài)學(xué)觀察 倒置顯微鏡下間質(zhì)細(xì)胞散在單個(gè)分布，密度大的區(qū)域細(xì)胞則聚集成堆。間質(zhì)細(xì)胞多呈圓形或多角形，大小不一，胞漿薄而透明，胞漿突起延伸相互連接，核圓居中，外觀呈伸展、挺直，類似成纖維細(xì)胞。細(xì)胞平鋪生長(zhǎng)，經(jīng)多次傳代后細(xì)胞體積變大，細(xì)胞伸長(zhǎng)成梭形，胞漿豐富，核橢圓，相互平行排列，可見(jiàn)少量梭狀的間質(zhì)細(xì)胞。間質(zhì)細(xì)胞波形蛋白染色陽(yáng)性，胞漿充滿棕色顆粒，角蛋白染色陰性，純度達(dá)90%以上。

3.2 TGF-β對(duì)ESC MMP-9的影響 ESC加入TGF-β培養(yǎng)48h后，在TGF-β 2.5ng/mL組MMP-9含量與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，TGF-β 5.0ng/mL組MMP-9含量下降顯著(P＜0.05)，TGF-β 10.0ng/mL組MMP-9含量達(dá)最低水平，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見(jiàn)表1。

表1 TGF-β對(duì)ESC MMP-9的影響(±s)pg/mL

表1 TGF-β對(duì)ESC MMP-9的影響(±s)pg/mL

注:與對(duì)照組比較，△P＜0.05;△△P＜0.01

組別 n/只 劑量/(ng/mL)MMP-9對(duì)照組10 0 620.26±36.56實(shí)驗(yàn)組 10 2.5 552.77±42.68 10 5.0 502.81±29.69△10 10.0 373.44±32.72△△

3.3 EGF對(duì)ESC MMP-9的影響 ESC加入EGF培養(yǎng)48h后，2.5ng/mL組MMP-9的分泌與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，EGF5.0ng/mL組MMP-9分泌增加明顯(P＜0.05)，EGF10.0ng/mL組MMP-9分泌達(dá)最高水平，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見(jiàn)表2。

表2 EGF對(duì)ESC MMP-9的影響(±s)pg/mL

表2 EGF對(duì)ESC MMP-9的影響(±s)pg/mL

注:與對(duì)照組比較，△P＜0.05;△△P＜0.01

MMP-9對(duì)照組10 0 620.26±36.56驗(yàn)組 10 2.5 291.22±33.79 10 5.0 751.18±44.11△10 10.0 857.39±41.91△△組別 n/只 劑量/(ng/mL)實(shí)

4 討論

胚胎著床是從受精卵植入子宮內(nèi)膜開(kāi)始的一系列細(xì)胞分子信號(hào)傳遞的過(guò)程，成功的植入取決于胚泡的侵入能力和子宮內(nèi)膜的容受性，該過(guò)程受到多種因素的調(diào)節(jié)，如激素、細(xì)胞因子、免疫因子以及黏附分子等［1］。有學(xué)者認(rèn)為，MMP-9可能參與胚泡植入過(guò)程中的組織重塑［2］，有利于胚胎著床過(guò)程中ECM的降解［3］。子宮內(nèi)膜可分泌多種調(diào)節(jié)MMP-9的合成與分泌的細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子，如TGF-β、EGF、IL(白細(xì)胞介素)、LIT(白血病抑制因子)等。

TGF-β是由多種細(xì)胞合成的一種多功能肽，通常以自分泌或旁分泌的方式刺激或抑制細(xì)胞的增殖和分化，具有極為廣泛的生物學(xué)活性［4］。國(guó)外學(xué)者在研究子宮內(nèi)膜癌、子宮肌瘤等疾病過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，TGF-β對(duì)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞分泌MMP-9具有不同程度的調(diào)節(jié)作用［5］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，TGF-β能增加小鼠MMP-9mRNA及proMMP-9的表達(dá)，并能誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的牛子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生MMP-9［6］。Amakar等［7］通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，TGF-β通過(guò)上調(diào)TIMP-1和下調(diào)MMP-9的表達(dá)，抑制MMP-9的表達(dá)和活性。本研究顯示，隨著TGF-β濃度的增高，體外培養(yǎng)的ESC分泌MMP-9降低，呈劑量依賴性。該結(jié)果與相關(guān)研究相似。

EGF是一種具有廣泛生物學(xué)活性的多肽，在人體多種組織中均有分布，人類生殖系統(tǒng)如子宮、卵巢、胎盤(pán)等亦含有EGF，其通過(guò)多種途徑對(duì)生殖功能、胎兒生長(zhǎng)發(fā)育及胎盤(pán)形成等產(chǎn)生影響［8］。EGF在人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞上均有表達(dá)，能夠誘導(dǎo)MMP-9的表達(dá)，增強(qiáng)其對(duì)細(xì)胞基底膜及細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而在細(xì)胞外基質(zhì)降解過(guò)程中發(fā)揮重要作用［9］。本研究表明，EGF能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)的ESC增加MMP-9的分泌，并且隨著EGF濃度的升高，其刺激作用也更加明顯，具有劑量依賴性。

胚胎植入是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，其機(jī)制尚未完全明了，但研究表明MMP-9與其有密切的關(guān)系。綜合分析本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為，TGF-β和EGF是調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞分泌MMP-9的重要因子，TGF-β和EGF可能通過(guò)調(diào)節(jié)體外培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞MMP-9的分泌進(jìn)而參與胚胎植入過(guò)程，其具體的作用機(jī)制尚需繼續(xù)探索。

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Effects of TGF－β and EGF on the Expression of MMP－9 in Human Endometrial Stromal Cells in the Mid－secre-

tory Phase

CHENG Jing，HUANG Zhaoxia，CHI Haihong，et al．The Second Affiliated Hospital＆Yuying Children's Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou(325000)，China

Objective:To detect the expression of matrix metalloproteinases-9(MMP-9)in cultured human endometrial stromal cells(ESC)added different concentrations of transforming growth factor β(TGF-β) and epidermal growth factor(EGF).MethodsThe isolated，purified ESC was planted to 1×105/well in 96-well plates，containing 10%FBS DMEM/F12 medium.After 24h culture，TGF-β and EGF were added to 200μl serum-free DMEM/F12 medium in each well and the final concentrations were 2.5ng/ ml，5.0ng/ml and 10.0ng/ml，respectively.The content of MMP-9 was measured by ELISA after 48h culture.ResultsCompared with the control group，the secretion of MMP-9 significantly decreased as the increasing concentration of TGF-β，while it was increase as the increasing concentrations of EGF，both showing a dose-dependent pattern.ConclusionTGF-β and EGF may be involved in human embryonic implantation by regulating ESC secreting MMP-9.

endometrial stromal cellsmid-secretory phase transforming growth factor-β epidermal growth factor matrix metalloproteinases-9

2011-01-11

·論 著·