TGF-β和EGF對人分泌中期子宮內膜間質細胞MMP-9的影響

程 靜 黃朝霞 池海紅 呂杰強 溫州醫學院附屬第二醫院婦產科生殖中心 溫州325000

TGF-β和EGF對人分泌中期子宮內膜間質細胞MMP-9的影響

程 靜 黃朝霞 池海紅 呂杰強 溫州醫學院附屬第二醫院婦產科生殖中心 溫州325000

目的:觀察轉化生長因子-β(TGF-β)和表皮生長因子(EGF)對人分泌中期子宮內膜間質細胞(ESC)基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)的影響。方法:體外培養ESC，分離、純化后的ESC以1 ×105個/孔接種于96孔板，加入含10%胎牛血清的 DMEM/F12培養液。24h后換無血清的DMEM/F12培養液，每孔200μL，分別加入TGF-β和EGF，終濃度均為2.5、5.0和10.0ng/mL，培養48h后通過ELISA法測培養液中MMP-9的含量。結果:與對照組比較，實驗組隨著TGF-β濃度的增加，ESC分泌的MMP-9明顯下降(P＜0.05，P＜0.01);而隨著EGF濃度的增加，ESC分泌的MMP-9則顯著上升(P＜0.05，P＜0.01)，且二者的變化具有劑量依賴性。結論:TGF-β和EGF可能通過調節人子宮內膜間質細胞MMP-9，而參與胚胎植入過程。

子宮內膜細胞 分泌中期 轉化生長因子-β 表皮生長因子 基質金屬蛋白酶-9

基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是具有許多共同生化特性、可降解細胞外基質(extracell matrix，ECM)的一類Zn2+依賴性蛋白水解酶，廣泛分布在人體各種組織和器官內。很多研究表明，MMP-9是MMPs家族中較重要的一種蛋白酶，其在各期子宮內膜均有表達，對于胚泡著床、胚胎植入以及胎盤形成以及子宮和胎兒血管系統的建立過程均發揮著重要的調節作用。本研究通過體外培養的人分泌期子宮內膜間質細胞(endometrial stromal cells，ESC)中分別加入不同濃度的轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)和表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)，檢測ESC分泌的MMP-9含量變化，探討TGF-β和EGF對胚胎植入過程的影響。

1 實驗材料

1.1 標本來源 取自因不孕癥診斷性刮宮術患者的子宮內膜(病理證實為分泌期)，患者年齡30～45歲，術前3個月內未使用性激素類藥物，無其他婦科疾患史及內分泌、免疫和代謝性疾病。術后在無菌條件下將刮取的子宮內膜組織放入冷D-Hanks液中立即進行子宮內膜間質細胞(ESC)分離培養。本研究經醫院倫理委員會論證批準，患者知情同意。

1.2 主要試劑 DMEM/F12培養基、胎牛血清、Ⅱ型膠原酶，TGF-β、EGF(Sigma公司產品);細胞培養瓶、6孔板、96孔板(Corning公司產品);鼠抗人波形蛋白單克隆抗體、鼠抗人角蛋白單克隆抗體(福州邁新生物技術開發公司);人基質金屬蛋白酶-9(MMP -9)ELISA試劑盒(上海滬峰化工有限公司)。

2 實驗方法

2.1 ESC分離與純化 所獲子宮內膜組織用PBS洗滌2～3次，用眼科剪將其剪成0.5～1mm3碎塊;加入2倍組織體積的膠原酶Ⅰ(0.2%)，37℃水浴箱震蕩消化30min;2%FBS細胞培養液漂洗2～3次，加入2倍組織體積的消化酶Ⅱ(0.1%膠原酶 +0.01% DNase)混合消化液，37℃水浴箱震蕩消化30min;100目篩網過篩去除大塊未消化組織，2%FBS細胞培養液漂洗2～3次，離心(800r/min×10min)去除上清液;沉淀部分用2%FBS細胞培養液懸浮后，經35μm的細胞篩過濾，收集通過濾網的細胞濾過液吸到離心管中，離心500r/min，5min，棄上清，將沉淀用DHanks液進行沖洗，再進行離心，反復進行2次;加入10%FBS DMEM/F12培養液，置37℃、5%CO2恒溫孵育箱中培養，隔日換液，以除去未貼壁的間質細胞和血細胞。

2.2 ESC鑒定 分離、純化的ESC傳代1次，將細胞以1×106個/孔接種于6孔板，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養液，放入蓋玻片，上述培養條件培養間質細胞。當細胞在上面長滿后，取出蓋玻片，以D-Hanks液反復洗滌3次，用冷丙酮固定10min，晾干，4℃冰箱過夜。將單克隆抗體角蛋白和波形蛋白按1∶75稀釋，用ABC法染色，以鑒定細胞類型，凡是胞質被染成棕黃色的為陽性細胞。

2.3 實驗分組 分離純化的ESC傳代1次，將細胞以1×105個/孔接種于96孔板，加入含10%胎牛血清的 DMEM/F12培養液。24h后換無血清的DMEM/F12培養液，每孔200μL，分別加入TGF-β和EGF，使其終濃度均分別為2.5、5.0、10.0ng/mL，每個濃度種5個孔;另設一列對照組，僅加入10% DMEM/F12培養液200μL。5%CO237℃培養48h后收集培養液，離心取上清，-20℃保存待測，每組實驗重復1次。

2.4 ELISA法檢測 檢測不同濃度TGF-β和EGF對ESC分泌的MMP-9影響，按試劑盒說明操作。

3 實驗結果

3.1 子宮內膜間質細胞(ESC)形態學觀察 倒置顯微鏡下間質細胞散在單個分布，密度大的區域細胞則聚集成堆。間質細胞多呈圓形或多角形，大小不一，胞漿薄而透明，胞漿突起延伸相互連接，核圓居中，外觀呈伸展、挺直，類似成纖維細胞。細胞平鋪生長，經多次傳代后細胞體積變大，細胞伸長成梭形，胞漿豐富，核橢圓，相互平行排列，可見少量梭狀的間質細胞。間質細胞波形蛋白染色陽性，胞漿充滿棕色顆粒，角蛋白染色陰性，純度達90%以上。

3.2 TGF-β對ESC MMP-9的影響 ESC加入TGF-β培養48h后，在TGF-β 2.5ng/mL組MMP-9含量與對照組差異無統計學意義(P＞0.05)，TGF-β 5.0ng/mL組MMP-9含量下降顯著(P＜0.05)，TGF-β 10.0ng/mL組MMP-9含量達最低水平，與對照組比較，差異有統計學意義(P＜0.01)，見表1。

表1 TGF-β對ESC MMP-9的影響(±s)pg/mL

表1 TGF-β對ESC MMP-9的影響(±s)pg/mL

注:與對照組比較，△P＜0.05;△△P＜0.01

組別 n/只 劑量/(ng/mL)MMP-9對照組10 0 620.26±36.56實驗組 10 2.5 552.77±42.68 10 5.0 502.81±29.69△10 10.0 373.44±32.72△△

3.3 EGF對ESC MMP-9的影響 ESC加入EGF培養48h后，2.5ng/mL組MMP-9的分泌與對照組差異無統計學意義(P＞0.05)，EGF5.0ng/mL組MMP-9分泌增加明顯(P＜0.05)，EGF10.0ng/mL組MMP-9分泌達最高水平，與對照組比較，差異有統計學意義(P＜0.01)，見表2。

表2 EGF對ESC MMP-9的影響(±s)pg/mL

表2 EGF對ESC MMP-9的影響(±s)pg/mL

注:與對照組比較，△P＜0.05;△△P＜0.01

MMP-9對照組10 0 620.26±36.56驗組 10 2.5 291.22±33.79 10 5.0 751.18±44.11△10 10.0 857.39±41.91△△組別 n/只 劑量/(ng/mL)實

4 討論

胚胎著床是從受精卵植入子宮內膜開始的一系列細胞分子信號傳遞的過程，成功的植入取決于胚泡的侵入能力和子宮內膜的容受性，該過程受到多種因素的調節，如激素、細胞因子、免疫因子以及黏附分子等［1］。有學者認為，MMP-9可能參與胚泡植入過程中的組織重塑［2］，有利于胚胎著床過程中ECM的降解［3］。子宮內膜可分泌多種調節MMP-9的合成與分泌的細胞因子及生長因子，如TGF-β、EGF、IL(白細胞介素)、LIT(白血病抑制因子)等。

TGF-β是由多種細胞合成的一種多功能肽，通常以自分泌或旁分泌的方式刺激或抑制細胞的增殖和分化，具有極為廣泛的生物學活性［4］。國外學者在研究子宮內膜癌、子宮肌瘤等疾病過程中發現，TGF-β對子宮內膜間質細胞分泌MMP-9具有不同程度的調節作用［5］。動物實驗顯示，TGF-β能增加小鼠MMP-9mRNA及proMMP-9的表達，并能誘導體外培養的牛子宮內膜間質細胞產生MMP-9［6］。Amakar等［7］通過體外實驗證實，TGF-β通過上調TIMP-1和下調MMP-9的表達，抑制MMP-9的表達和活性。本研究顯示，隨著TGF-β濃度的增高，體外培養的ESC分泌MMP-9降低，呈劑量依賴性。該結果與相關研究相似。

EGF是一種具有廣泛生物學活性的多肽，在人體多種組織中均有分布，人類生殖系統如子宮、卵巢、胎盤等亦含有EGF，其通過多種途徑對生殖功能、胎兒生長發育及胎盤形成等產生影響［8］。EGF在人子宮內膜上皮細胞和間質細胞上均有表達，能夠誘導MMP-9的表達，增強其對細胞基底膜及細胞外基質的降解，從而在細胞外基質降解過程中發揮重要作用［9］。本研究表明，EGF能夠促進體外培養的ESC增加MMP-9的分泌，并且隨著EGF濃度的升高，其刺激作用也更加明顯，具有劑量依賴性。

胚胎植入是一個非常復雜的過程，其機制尚未完全明了，但研究表明MMP-9與其有密切的關系。綜合分析本實驗結果，我們認為，TGF-β和EGF是調節子宮內膜間質細胞分泌MMP-9的重要因子，TGF-β和EGF可能通過調節體外培養的子宮內膜間質細胞MMP-9的分泌進而參與胚胎植入過程，其具體的作用機制尚需繼續探索。

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Effects of TGF－β and EGF on the Expression of MMP－9 in Human Endometrial Stromal Cells in the Mid－secre-

tory Phase

CHENG Jing，HUANG Zhaoxia，CHI Haihong，et al．The Second Affiliated Hospital＆Yuying Children's Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou(325000)，China

Objective:To detect the expression of matrix metalloproteinases-9(MMP-9)in cultured human endometrial stromal cells(ESC)added different concentrations of transforming growth factor β(TGF-β) and epidermal growth factor(EGF).MethodsThe isolated，purified ESC was planted to 1×105/well in 96-well plates，containing 10%FBS DMEM/F12 medium.After 24h culture，TGF-β and EGF were added to 200μl serum-free DMEM/F12 medium in each well and the final concentrations were 2.5ng/ ml，5.0ng/ml and 10.0ng/ml，respectively.The content of MMP-9 was measured by ELISA after 48h culture.ResultsCompared with the control group，the secretion of MMP-9 significantly decreased as the increasing concentration of TGF-β，while it was increase as the increasing concentrations of EGF，both showing a dose-dependent pattern.ConclusionTGF-β and EGF may be involved in human embryonic implantation by regulating ESC secreting MMP-9.

endometrial stromal cellsmid-secretory phase transforming growth factor-β epidermal growth factor matrix metalloproteinases-9

2011-01-11

·論 著·