扶正敗毒顆粒對膿毒癥大鼠急性肺損傷保護作用的實驗研究*

張 韌 王丁超 蘇秀平 高 翔 王 靜 吳桂玲 陳曉敏

1河南省濮陽市中醫院（河南濮陽457003）

2河南省中醫院（河南鄭州450008）

急性肺損傷（ALI）是臨床上常見的急性呼吸系統功能失常，其中由感染導致的膿毒血癥是引起ALI的最常見的病因。目前認為膿毒癥是炎癥失控導致的紊亂，是機體對微生物產物發生失控的免疫反應［1］，其中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是膿毒癥發生早期的重要炎性細胞因子，大量釋放則對機體造成損傷，白細胞介素-1（IL-1）可與 TNF-α 協同作用加重多器官損傷［2］。 本實驗以膿毒癥大鼠為研究對象，觀察大鼠不同時間點的肺組織含水量、動脈血氣變化、肺組織IL-1、TNF-α表達變化，探討中藥復方扶正敗毒顆粒對膿毒癥大鼠肺損傷的保護作用。

1 材 料

1.1 實驗動物 青年SD大鼠，清潔級，雌雄各半，鼠齡3～4月，體質量（300±50）g，154只。 由河南實驗動物中心提供，合格證號：scxk（豫）2009-0006。

1.2 藥品與儀器 扶正敗毒顆粒（濮陽市中醫院中藥制劑室提供）；烏司他丁（廣東天普生化醫藥股份有限公司生產，批號：國藥準字 S19990050）；IL-1單克隆抗體及TNF-α單克隆抗體均由武漢博士德生物工程有限公司提供。光學顯微鏡（Olympus optical Co.LTD，JAPAN，型號 PM-10AD）。電子天平（上海精科天平廠，型號 JA1203）。

1.3 分組與造模 將SD大鼠按隨機數字表法分為模型組、扶正敗毒顆粒組、烏司他丁組及扶正敗毒顆粒聯合烏司他丁聯合組（聯合組）各36只，假手術組10只。參考文獻［3-4］加以改良制備膿毒癥動物模型。水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，待完全麻醉后，仰臥位固定大鼠，頸部皮膚常規備皮、消毒，于頸外側下頜至心臟的中點作一約1cm的橫切口，鈍性分離皮下組織，暴露右側頸外靜脈，沿血管向近心端方向插入留置針約1cm，將導管從留置針管與頸外靜脈夾孔中把心導管慢慢置入達右心房，結扎固定，導管末端經皮下隧道從頸后中央引出并固定于皮膚，管內注射125U/mL肝素0.5mL抗凝，插入置管針封閉導管。然后沿腹白線中段作3cm切口，探查取出盲腸，用4號絲線距盲端1cm處結扎，用12號針穿刺3孔，擠出少許糞便于腹腔內，回納盲腸，分層縫合腹腔。手術過程中保持大鼠肛溫（37.0±0.5）℃，保持室溫（26.0±1.0）℃。

1.4 給藥方法 假手術組、模型組、烏司他丁組分別于造模后第1日用生理鹽水灌胃，同時扶正敗毒顆粒組、聯合組用扶正敗毒顆粒（36.8mg/100g）灌胃（灌胃容積為1mL/100g），每日灌胃1次直至取材；烏司他丁組、聯合組大鼠分別于造模后第1日腹腔內注射烏司他丁（1萬U/㎏），假手術組、模型組、扶正敗毒顆粒組同時用同等容積的生理鹽水腹腔注射，每日1次直至取材。

1.5 標本采集與檢測 （1）腹主動脈血氣：測定大鼠口腔溫度，并記錄，取腹主動脈血2mL采用電極法進行血氣測定，PaO2、PaCO2。（2）肺組織含水量：稱取肺組織濕重，然后放入恒溫箱（100±2℃）干燥，24h后取出，稱取干重，計算肺組織含水量。計算公式：肺組織含水量=（肺濕重-肺干重）/肺濕重×100%，以%表示。（3）臟器組織IL-1，TNF-α表達：檢測采用免疫組織化學SP法檢測，在400倍光鏡下觀察，細胞膜、細胞漿呈棕色為免疫組化陽性；用Image-Pro Plus 5.1專業圖像采集與分析系統采集圖像，并進行半定量分析，每張切片隨機選取不重疊的5個視野拍照，測定其平均吸光度及陽性細胞數，取其平均值代表各細胞因子的表達水平。（4）病理觀察：取肺組織4%多聚甲醛固定，經脫水、透明、浸蠟、包埋，切成4～6μm厚的切片，常規脫蠟、脫水，蘇木素-伊紅（HE）染色，脫水、透明、封片。光學顯微鏡觀察肺、腸組織病理形態學改變。

1.6 統計學處理 應用SPSS13.0統計軟件。計量資料采用單因素方差分析方法，數據以s）表示；組內差異比較采用單因素方差分析兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠動脈血PaO2、PaCO2比較 見表1。與假手術組比較，模型組動脈血 PaO2顯著降低，PaCO2顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，扶正敗毒顆粒和烏司他丁及聯合組PaO2升高，PaCO2下降，以聯合7d組尤為顯著（P＜0.01）；與扶正敗毒顆粒通組比較，烏司他丁組無顯著差異（P＞0.05），見表1。

表1 各組大鼠動脈血PaO2、PaCO2比較 （mmHg，

表1 各組大鼠動脈血PaO2、PaCO2比較 （mmHg，

與假手術組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01； 與模型組比較，◇P＜0.05，◇◇P＜0.01；與扶正敗毒顆粒組比較，▽P＜0.05；與聯合組比較，〇P＜0.05，〇〇P＜0.01；與 2d組比較，□P＜0.05，□□P＜0.01；與 3d組比較，*P＜0.05，*P＜0.01。 下同。

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2.2 肺組織含水量變化結果 見表2。與假手術組比較，模型組大鼠肺組織含水量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，扶正敗毒顆粒和烏司他丁及聯合組含水量均顯著降低 （P＜0.05或0.01），與2d、3d組相比，扶正敗毒顆粒和烏司他丁7d組的肺組織含水量均顯著降低（P＜0.05或0.01），以聯合7d組下降尤為顯著（P＜0.01）。

表2 各組大鼠含水量比較（

表2 各組大鼠含水量比較（

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2.3 肺組織TNF-α、IL-1的表達變化 見表3。與假手術組比較，模型組大鼠肺組織TNF-α、IL-1表達均升高 （P＜0.05或0.01）；與模型組相比，扶正敗毒顆粒和烏司他丁及聯合組各時間點 TNF-α、IL-1的表達水平均顯著下降（P＜0.05或 0.01），以聯合7d組的尤為顯著（P＜0.01）；與聯合組相比，扶正敗毒顆粒組和烏司他丁組TNF-α、IL-1表達水均顯著升高 （P＜0.05或0.01），以 2d組尤為顯著（P＜0.01）。與 2d 、3d組相比，以聯合 7d組 TNF-α、IL-1 表達水平下降尤為顯著（P＜0.01）。

表3 各組大鼠肺組織TNF-α、IL-1陽性細胞表達變化（IOD，

表3 各組大鼠肺組織TNF-α、IL-1陽性細胞表達變化（IOD，

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2.4 肺組織病理改變 假手術組大鼠肺組織可見肺泡大一致，肺泡壁菲薄，支氣管上皮完整，管腔內無分物，支氣管上皮正常，外周無炎性細胞浸潤。模型2d組可見肺間質有單核細胞、淋巴細胞浸，肺組織出現散在性病灶；3d組可見病灶增大、數量多，肺泡壁廣泛淋巴細胞及單核細胞浸潤，有些區域可見肺泡出血，肺泡壁結構不清。7d組更為明顯，肺泡腔內滿布炎性滲出物、血性滲出物明顯，大量上皮脫落，肺泡壁結構不清，大片的肺實變。扶正敗毒顆粒組在第2、3、7日均較模型組有顯著改善，病變范圍、程度均較模型組明顯減輕。聯合7d組改善尤為顯著，表現為病變范圍較局限，炎細胞密度較低，肺泡腔內滲出物少，肺泡結構較模型組完整。

3 討 論

ALI主要是因機體炎癥反應失控所導致的器官損傷［5］。本組資料顯示模型組大鼠肺組織炎性因子TNF-α，IL-1表達水平明顯高于假手術組，表明促炎細胞因子在膿毒癥大鼠急性肺損傷損傷中發揮了重要作用。TNF-α是由活化的巨噬細胞、單核細胞和T淋巴細胞產生，具有核心作用，是導致炎癥介質級聯反應的始發因子。一旦TNF-α被分泌出來，炎癥連鎖反應即被啟動，促進其他細胞因子的激發釋放，引起組織損害。有報道促炎癥細胞因子TNF-α在感染性休克中發揮關鍵作用，直接導致某些臟器的損傷［6］。IL-1是另一種主要由巨噬細胞產生的促炎性細胞因子，是體內調節免疫和炎癥反應的中心介質，是細胞因子網絡中的關鍵因子，能激活多種免疫和炎癥細胞：刺激單核細胞和巨噬細胞產生IL-6和TNF-α；刺激中性粒細胞釋放炎癥介質；誘導內皮細胞活化，與TNF-α協同作用，促進血管內皮-白細胞黏附分子的表達，趨化中性粒細胞等炎癥細胞進人病變部位，增加血管內皮通透性，加重組織損傷［7-8］。所以，降低促炎細胞因子TNF-α，IL-1水平對防止ALI具有重要意義。本實驗結果顯示，扶正敗毒顆粒能夠降低組織炎性因子TNF-α，IL-1表達水平，提示扶正敗毒顆粒通過降低臟器組織中炎性細胞因子TNF-α，IL-1含量，進而減輕膿毒癥大鼠多器官損傷和降低死亡率。

綜上所述，促炎因子TNF-α，IL-1在ALI中發揮了重要作用，扶正敗毒顆粒能夠降低臟器組織中TNF-α，IL-1表達水平以減輕臟器損傷；降低了肺組織的含水量，提高動脈血氧含量，對膿毒癥大鼠具有確實的防護作用，為扶正敗毒顆粒防治膿毒癥性MODS提供了參考。

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