辛基酚聚氧乙烯醚降解菌的分離鑒定及降解特性研究

張 諤，俞國平

（同濟大學環境科學與工程學院，上海200092）

烷基酚聚氧乙烯醚（Alkylphenol polyethoxylates，APEOn），例如辛基酚聚氧乙烯醚（OPEOn）是重要的非離子表面活性劑。研究發現，APEOn的生物降解產物烷基酚（alkylphenol，AP）、烷基酚乙烯醚低聚物APEO1和APEO2等具有內分泌干擾物活性［1－4］，其中辛基酚（Octylphenol，OP）是APEOn降解產物中環境雌激素活性最強的［5－6］，其雌激素效應比壬基酚強40余倍［7］。本研究從農田土壤及池塘水中分離得到2株OPEOn降解菌，并對其進行了16SrDNA鑒定和降解性能試驗考察，旨在揭示OPEOn生物降解規律，以期為OPEOn污染的生物防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑材料

辛基酚聚氧乙烯醚（OPEOn）（AMRESCO公司），商品名Triton X－100，Reagent Grade，由各種不同支鏈的同分異構體組成，乙氧基平均鏈長為9.5。

1.2 菌種富集、分離純化和培養基組成

試驗樣品于2006年11月取自上海市閔行區幸福村農田土壤及池塘水，共11份。

配制無機鹽溶液（g／L）：NaCl（2.5），（NH4）2SO4（2.0），MgSO4·7H2O（0.3），CaCl2（0.01），Na2HPO4（3.7），KH2PO4（0.9），Vitamin溶液：2mL／L，Trace element溶液：1mL／L，pH值為6.8～7.0。

Vitamin溶液成分如下（mg／L）：pyridoxine hydrochloride（10.0），riboflavin（5.0），thiamine hydrochloride（5.0），nicotinic acid（5.0），lipoic acid（5.0），p－aminobenzoic acid（5.0），biotin（2.0），folic acid（2.0），vitamin B12（0.1）。

Trace element溶液的成分如下（mg／L）：MnCl2· H2O（20.0），CoCl2·6H2O（4.0），Na2MO4·2H2O（26.0），FeCl3·6H2O（15.0），配好后經高壓滅菌（120℃，20min）備用。

1.3 16SrDNA擴增和序列測定

收集菌體，提取DNA作為擴增模板。16SrDNA擴增的PCR反應所用的正向引物Pf：5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′；反向引物Pr：5′－GGTTACCTTGTTACGACTT－3′，分別對應于大腸桿菌的16SrRNA基因的8－27和1492－1510堿基。引物合成及測序工作由上海基康生物技術有限公司完成，PCR反應體系（25μL）為：10×PCR緩沖液2.5μL，MgCl2（25mM）1μL，dNTP（2.5 mM）1μL，引物各0.5μL，模板DNA 1μL，Taq酶（5U／μL）0.25μL，重蒸水18.25μL。

1.4 OPEOn降解菌生長曲線及總有機碳的測定

OPEOn降解菌生長曲線的測定采用WFJ7200型可見分光光度計，測定菌液的OD600值。

菌液中未被降解的OPEOn的含量采用TOC儀測定。菌液在高速離心機中以4 000r／mim離心5min后，取上清液按比例稀釋后測定TOC值。TOC儀為Multi N／C 3000TOC／TN Analyzer，進樣量20mL。

2 結果與討論

2.1 OPEOn降解菌的分離

使用以OPEOn為唯一碳源的培養基，對11份土壤及池塘水樣進行4個月馴化后，生長明顯的3份進行固體平板劃線分離，挑取單菌落，反復劃線純化，共分離得到3株可降解OPEOn的菌株。測定5d內對100mg／L OPEOn的降解能力，結果如表1所示，其中以菌株X－4及X－6的降解率最高，因此選擇X－4及X－6作為進一步研究的菌種。

表1 OPEOn降解菌的降解率

2.2 菌株鑒定

2.2.1 菌落形態及生化鑒定

菌株X－4菌落直徑大小為1～1.5mm，圓形，邊緣整齊，有光澤，呈淡黃色，精氨酸雙水解酶反應呈陰性，革蘭氏反應呈陽性；菌株X－6菌落直徑大小為1～1.5mm，圓形，邊緣整齊，有光澤，呈乳白色，半透明，精氨酸雙水解酶反應呈陰性，革蘭氏反應呈陰性。

2.2.2 16SrDNA序列測序結果分析

菌株X－4的16SrDNA共測得1 453個堿基，X－6為825個堿基，所得序列在GenBank上登錄，登錄號分別為DQ 286 360.1及AY 987 735.1／AM 184 292.1。結果表明，菌株X－4與菌種Bacillus sphaericus親源關系最近，二者的16SrDNA的相似性為99%。菌株X－6與菌株Aeromonas hydrophila或Aeromonas punctata親源關系最近，X－6與2菌株的16SrDNA的相似性均為99%。結合菌株的形態和生理生化特征，菌株X－4初步鑒定為Bacillus sphaericus，X－6為Aeromonas hydrophila或Aeromonas punctata。

2.3 接種量對OPEOn降解的影響

在一系列初始pH值為7.0的無機鹽培養基中，分別以0.5%，1.0%，1.5%，2.0%的接種量分別接入X－4，X－6菌體，OPEOn初始濃度均為20 mg／L，置于30℃，150r／min搖床避光培養，每24h取樣1次，測定其TOC值。接種量對菌株X－4，X－6降解OPEOn的影響見圖1和圖2。

圖1 接種量對菌株X－4降解能力的影響

圖2 接種量對菌株X－6降解能力的影響

由圖1和圖2可見，接種量在0.5%～2.0%時，降解OPEOn的速率和起始接種量呈正相關?？紤]到本試驗中單純使用以TOC值表征的OPEOn含量的變化并不能說明不同接種比下，OPEOn的降解效率，故自定義“接種效率”概念，“接種效率”的計算方法如下：

由此公式可以計算得出：菌株X－4在接種比為1.0%時，“接種效率”最高，達到22.9%；菌株X－6在接種比為1.5%時，“接種效率”最高，達到22.0%。此外，當接種比為1.0時，X－6的“接種效率”為21.2%。在本次試驗中，為簡化操作，設定2菌株的接種比均為1.0%。

2.4 OPEOn培養基濃度對降解的影響

配制OPEOn濃度分別為5，20，50，100，200，1 000mg／L的OPEOn培養基，溶劑為無機鹽溶液，pH值為7.0。菌株X－4及X－6均以1%的接種比接入各濃度培養基。接菌后置于30℃，150r／min搖床避光培養，每24h取樣1次，并測TOC值。OPEOn濃度對菌株X－4及X－6降解OPEOn的影響見圖3和圖4。

圖3 OPEOn濃度對菌株X－4降解能力的影響

圖4 OPEOn濃度對菌株X－6降解能力的影響

由圖3和圖4可見，菌株X－4及X－6均在培養基OPEOn濃度為20mg／L時，達到最高降解率。Boopathy［8］曾指出，培養基中有機物含量過高，會對菌體生長產生抑制作用或毒害作用，太低則會限制菌體的生長。Hsi－Jien Chen［9］等研究了5種OPEOn降解菌的降解性能，所使用培養基中OPEOn濃度范圍為0.1mg／L～100 000mg／L，5種OPEOn降解菌生長的最適OPEOn濃度，最低質量濃度為100mg／L，最高質量濃度為10 000mg／L。

2.5 pH值對OPEOn降解的影響

分別將OPEOn濃度為20mg／L的培養基調pH值至5.0，6.0，6.5，7.0，7.3，7.5，8.0，8.5，9.0，以1%的接種比接入菌株X－4及X－6，于30℃，150 r／min搖床避光培養5d，測其OD 600值。和大多數生物體一樣，細菌對胞內外環境pH值都有一定的要求。pH值對菌株X－4及X－6降解OPEOn的影響見圖5和圖6。

圖5 pH值對菌株X－4降解能力的影響

圖6 pH值對菌株X－6降解能力的影響

圖5和圖6表明，菌株X－4及X－6均可以在pH值為6.0～8.5的范圍內降解OPEOn。在pH值為7.3～7.5時，2菌株對OPEOn的降解率最高，這可能是由于2菌株均于冬季取自農田土壤及池塘，而此季節動植物及微生物新陳代謝緩慢，酸性物質產生較少，故土壤偏堿性，因此其中存在的微生物適應在中性偏堿性環境下生長［10］。

2.6 溫度對OPEOn降解的影響

配制OPEOn質量濃度為20mg／L，pH值為7.5的培養基，以1.0%的接種比接入菌株X－4及X－6，分別于10℃，20℃，30℃，40℃，50℃，60℃，150r／min搖床避光培養5d，每12h取樣測其OD 600值，結果見圖7和圖8。

圖7 溫度對菌株X－4降解能力的影響

圖8 溫度對菌株X－6降解能力的影響

由圖7和圖8可知，2菌株對低溫環境的適應能力要強于高溫環境，可能與菌株采集的時間是在冬季有關，故2菌株可能有較強的抗寒能力。2菌株在10～40℃之間都有明顯的生長，但在50℃以上時，菌株生長基本已停止。2菌株的最適生長溫度為30℃，此時，菌株的降解率達到最大，X－4為26%，X－6為32%。Mann［11］等研究了OPEOn在污水處理系統中的生物降解性，發現OPEOn的生物降解性從3月的26%升高到8月末9月初的80%，而從10月到第2年的1月其降解性降低到20%～25%。他們認為生物降解性的這種隨時間的變化受溫度對生物活性的控制。在冷冬，溫度低，生物降解性降低。實驗結果與此相符。Nasu［12］和Maruyama［13］等人對壬基酚聚氧乙烯醚（NPEOn）生物降解的研究也證實了這一點。

2.7 降解動力學分析

對菌株X－4及X－6在不同OPEOn濃度下的降解率進行數學分析。

建立Monod模型，得到一級反應動力學方程式為：lnc＝－kt＋A

式中：c為OPEOn的質量濃度，mg／L，k為OPEOn降解速率的動力學常數；t為生物降解時間，d；A為常數；y為OPEOn的降解率。

運用MATLAB對試驗結果進行了計算和分段擬合（見表2，表3）。

表2 不同初始濃度下X－4對OPEOn生物降解的動力學方程

表3 不同初始濃度下X－6對OPEOn生物降解的動力學方程

結果表明，2菌株的降解反應均在低濃度（5，20，50，100mg／L）時符合一級反應動力學特征，所得的動力學方程能較好地描述試驗中的反應趨勢，而在較高底物濃度（200，1 000mg／L）下降解反應并不符合一級反應動力學，2菌株對OPEOn的降解率均在初始濃度為20mg／L時達到最大值，其中X－4為26%，X－6為32%。這表明微生物降解OPEOn的過程存在一個合適的降解濃度，底物一方面可以誘導降解酶活性的提高，另一方面也抑制細菌的生長和生理活動，需充分考慮OPEOn濃度與微生物數量的關系。

另外，從圖3及圖4還可以看出，各濃度下OPEOn的降解率在3d以后變化緩慢，OPEOn濃度基本不再發生變化，出現這一現象的可能原因為：隨著降解過程的進行，溶液中出現了較OPEOn更難降解的中間產物，如OP，OPEO 1，OPEO 2，OPEC 1，OPEC 2等短乙氧基鏈化合物。由于苯環的存在，OP，OPEO 1，OPEO 2，OPEC 1，OPEC 2在環境中具有很高的穩定性，不易被降解［14］，且具有更強的環境雌激素效應［15］。當其濃度累積到一定水平時會對微生物產生抑制。本課題目前只對OPEOn降解菌的降解特性進行了研究，進一步的研究應該包括對降解菌液進行分析，確定降解產物，以便構建2菌株對OPEOn的降解途徑。

3 結 論

（1）從上海閔行幸福村農田土壤及池塘水中分離得到2株能夠降解內分泌干擾物辛基酚聚氧乙烯醚（OPEOn）的菌株X－4及X－6，初步鑒定X－4為球形芽孢桿菌（Bacillus sphaericus），X－6為嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）或點狀產氣單胞菌點狀亞種（Aeromonas punctata）。

（2）菌株X－4降解OPEOn的最佳條件是接種量為1.0%，初始pH值為7.3～7.5，溫度為30℃；X－6是接種量為1.5%，初始pH值為7.3～7.5，溫度為30℃。

（3）菌株X－4及X－6對OPEOn的降解反應在低濃度（5，20，50，100mg／L）時符合一級反應動力學特征，而在較高底物濃度（200，1 000mg／L）下不能用一級反應動力學描述，2菌株對OPEOn的降解率在初始濃度為20mg／L時達到最大值，其中X－4為26%，X－6為32%。

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