豚鼠皮膚光過敏試驗方法的建立

楊文祥，孫凡中，王 成，侯學(xué)文，樊柏林

（湖北省疾病預(yù)防控制中心，武漢 430079）

光過敏反應(yīng)為IV型過敏反應(yīng)的特殊類型，是局部給藥后，涂布在皮膚中具有感光作用的化學(xué)物質(zhì)與光線產(chǎn)生復(fù)合作用，給受試物后皮膚對光線產(chǎn)生的不良反應(yīng)，主要表現(xiàn)為藥疹、接觸性皮炎、剝脫性皮炎等。衛(wèi)生部2007年頒布的《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》中要求，化妝品新原料如具有紫外線吸收特性，則需進行皮膚光毒性試驗及皮膚光過敏試驗。關(guān)于豚鼠皮膚光過敏試驗，國內(nèi)很少有相關(guān)研究報道，

本研究旨在探討建立豚鼠皮膚光過敏試驗方法，供測試化妝品新原料和新化學(xué)物質(zhì)的皮膚光過敏性時參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物：普通級 Hartley豚鼠，雄性，12只，282.7±37.0 g，湖北省實驗動物研究中心提供［SCXK（鄂）2008-0005］，實驗動物質(zhì)量合格證號為（00006850）。豚鼠飼養(yǎng)于湖北省實驗動物研究中心豚鼠房，該設(shè)施使用許可證號為SYXK（鄂）2008-0014，設(shè)施使用使用證明編號為（00008933）。環(huán)境溫度23℃ ±3℃，相對濕度55％ ±15％，光照時間12 h/12 h，光強度150～300 lux。

表1 豚鼠分組及致敏激發(fā)劑量Tab.1 Group Identification of Guinea Pigs

1.1.2 試劑：陽性物：3，5，4’-Tribromosalicylanilide （TBS），用丙酮配制成2％溶液備用（批號T0356，東京化工工業(yè)株式會社（T.C.I））；溶劑：丙酮（批號20081230，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）

1.1.3 儀器設(shè)備：UV-A光源：MUA-165（日本MEJIRO GENOSSEN公司）；UV-A紫外輻照計（雙通道）（配 UV-365探頭，北京師范大學(xué)光電儀器廠）；UV-B紫外輻照計（雙通道）（配UV-254探頭，北京師范大學(xué)光電儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組：

動物分為兩組，分別為陰性對照組和陽性對照組。陽性對照為 TBS（2％濃度，丙酮作為溶劑）［1-3］，陰性對照為丙酮。具體分組及劑量見表1。

1.2.2 誘導(dǎo)和致敏

1.2.2.1 輻照時間的確定：將豚鼠固定板放置在紫外輻照裝置的工作面上，在紫外光輻照處放置紫外輻照計，并調(diào)整紫外輻照計的測定面高度大概在豚鼠輻照點高度，測定其中一個透鏡的輻照強度，測定值為40.0 mW/cm2，再將輻照計分別放到其余4個透鏡下方相同高度處，調(diào)整透鏡的高度，使其輻照值為40.0 mW/cm2。按照致敏時輻照強度為30 J/cm2要求［1］，確定輻照時間為750.0 s，設(shè)定紫外輻照裝置自動時間為750.0 s。

1.2.2.2 致敏方法：試驗前一天，對豚鼠頸背部皮膚剃毛，剃毛范圍為3.0 cm×3.0 cm。誘導(dǎo)和致敏時采用俯臥式固定豚鼠四肢，均勻涂抹配置好的供試品、陽性物質(zhì)或陰性對照品0.1m l于剃毛部位，30min后置于紫外輻照裝置上進行輻照。按照計算的輻照時間照射750.0 s，完畢后取下固定的豚鼠，用37℃左右注射用水擦拭供試品。

致敏時間及次數(shù)：致敏分為3次，分別為第1天、第4天、第7天［4］。致敏方法同上。

1.2.3 激發(fā)

1.2.3.1 輻照時間的確定：按照致敏時的方法計算輻照時間，設(shè)定豚鼠輻照點的輻照強度為 40.0 mW/cm2，按照致敏時輻照強度為9 J/cm2要求［1］，確定輻照時間為225.0 s，設(shè)定紫外輻照裝置自動時間為225.0 s。

1.2.3.2 激發(fā)方法：試驗前一天，對豚鼠尾背部皮膚剃毛，剃毛范圍為4.0 cm×4.0 cm，在剃毛區(qū)域每一側(cè)對稱的標記一正方形區(qū)域（1.5 cm×1.5 cm），一共A、B、C、D 4個區(qū)域供激發(fā)用（見圖1）。采用俯臥式固定豚鼠四肢，均勻涂抹配置好的供試品、陽性物質(zhì)或陰性對照品0.02m l于剃毛部位A、B點，C、D點不涂藥，30 m in后置于紫外輻照裝置上進行輻照，輻照時間照射225.0 s。

輻照時采用組合的方式進行，豚鼠左側(cè)2個區(qū)域輻照（A、C點），右側(cè)2個區(qū)域（B、D點）用錫紙包裹不輻照，比較各區(qū)域皮膚反應(yīng)情況。完畢后取下固定的豚鼠，用37℃左右注射用水擦拭供試品。

圖1 豚鼠光過敏試驗激發(fā)示意圖Fig.1 Challenge sketch map of photosensitization

1.2.3.3 激發(fā)時間及次數(shù)：采用一次激發(fā)的方式，于第一次致敏誘導(dǎo)后第28天進行激發(fā)。

1.2.4 觀察指標：

每天觀察每只動物的臨床表現(xiàn)，給予光激發(fā)后的24、48、72 h觀察皮膚反應(yīng)。每只動物在獲取、分組、致敏第一天、致敏期間每周、激發(fā)前一天、結(jié)束時稱取體重記錄。于光激發(fā)后的第24、48、72 h，按照表2（Draize scale）［5］評價皮膚紅斑、焦痂形成和水腫評分。分值為1～4分的動物判定為光致敏陽性，供試品的光致敏陽性率采用下表公式計算。供試品的光致敏潛力根據(jù)平均皮膚評分分值和陽性率來判定（見表3）。

表2 豚鼠光過敏試驗皮膚反應(yīng)的觀察［5］Tab.2 Observation of skin reaction

表3 豚鼠光過敏試驗皮膚反應(yīng)的評價［5］Tab.3 Evaluation of skin photo sensitization in guinea pigs

2 結(jié)果

2.1 豚鼠致敏期間皮膚反應(yīng)情況及全身反應(yīng)

豚鼠致敏期間，陰性對照組和陽性對照組所有豚鼠均可見紫外線照射后立即出現(xiàn)輕度紅斑，包括涂藥區(qū)域以外紫外照射部位也出現(xiàn)輕度紅斑；紅斑在照射后4 d左右消失。

2.2 激發(fā)后皮膚反應(yīng)評分結(jié)果

陽性對照組（TBS）覆蓋鋁箔側(cè) B、D點（UV-A未照射區(qū)域）均為出現(xiàn)紅斑及水腫反應(yīng)；陽性對照組（TBS）未覆蓋鋁箔側(cè)（UV-A照射區(qū)域）A點（給藥區(qū)域）5只豚鼠均出現(xiàn)輕度至中度紅斑，2只可見皮膚輕度水腫，B點（未給藥區(qū)域）5只豚鼠均未見紅斑或水腫反應(yīng)。

陰性對照組陽性率為0，陽性對照組陽性率為100％。評分結(jié)果見表4。

表4 豚鼠光過敏反應(yīng)激發(fā)評分表Tab.4 Skin reactions in photosensitization test in guinea pigs

3 討論

豚鼠皮膚光過敏試驗在國內(nèi)開展很少，在實驗過程中會出現(xiàn)很多問題，本試驗將實驗過程中出現(xiàn)的問題及解決方法同大家交流。

3.1 陽性物溶劑的問題

TBS一般采用丙酮溶解，每次配制陽性物時需要現(xiàn)配現(xiàn)用［1，3］。

3.2 供試品誘導(dǎo)和激發(fā)濃度的確定

通過預(yù)試確定供試品致敏及激發(fā)濃度。將供試品采用倍比稀釋的方式，以0.2 m L/點涂抹于豚鼠皮膚各區(qū)域，并用紗布和玻璃紙包裹4 h左右，觀察24 h和48 h刺激反應(yīng)。以最小刺激濃度作為致敏濃度，最大無刺激濃度作為激發(fā)濃度［3，5，6］。

3.3 關(guān)于照射部位皮膚處理的問題

國外文獻報道一般采用膠帶（3 M）將照射部位皮膚角質(zhì)層充分的粘附，以利于供試品或陽性物的吸收［1，4］。

3.4 關(guān)于照射強度的問題

UV光源在照射過程中，較為容易產(chǎn)生的問題是皮膚表層發(fā)熱導(dǎo)致灼傷，因而影響皮膚紅斑、水腫反應(yīng)的評價，因此，實驗過程中，建議在保證照射劑量的前提下，盡量采用較高強度的UV-A光照，從而縮短照射時間，減少因長時間照射所導(dǎo)致的皮膚灼傷［1］。

3.5 關(guān)于紅斑和水腫的評價

豚鼠光過敏試驗陽性的判斷需要非常細致的觀察，觀察時，一定要將豚鼠表層被毛剔除干凈，同時要避免因剃毛過程中剃刀對皮膚造成的損傷而導(dǎo)致誤判。3.6 關(guān)于光過敏試驗和光毒性試驗皮膚反應(yīng)的判定問題

豚鼠皮膚光過敏反應(yīng)和豚鼠皮膚光毒性反應(yīng)的皮膚反應(yīng)均表現(xiàn)為紅斑、水腫等皮膚反應(yīng)。光毒性主要是由光直接加強化學(xué)物質(zhì)所致的原發(fā)性皮膚反應(yīng)，而未通過機體免疫機制，一般由皮膚初次接觸受試物，并在光能作用下誘發(fā)引起；而光過敏反應(yīng)則不同，一般化學(xué)物質(zhì)單獨與皮膚接觸無作用，經(jīng)過激發(fā)接觸和特定波長光照射后，局部皮膚出現(xiàn)紅斑、水腫、甚至全身反應(yīng)，而未照射部位不出現(xiàn)此反應(yīng)。

［1］Kobayashi I，Hosaka K，Maruo H，et al.Skin toxicity of propranolol in guinea pigs［J］.JToxicol Sci，1999，24（2）：103 -112.

［2］Momma J，Kaniwa M，Sekiguchi H，et al.Dermatological evaluation of a flame retardant， hexabromocyclododecane （HBCD） on guinea pig by using the primary irritation，sensitization，phototoxicity and photosensitization of skin［J］.Eisei Shikenjo Hokoku，1993（111）：18-24.

［3］Srivastava L P，Misra R B，Joshi P C.Photosensitizing potential of benzanthrone［J］.Food Chem Toxicol，1990，28（9）：653 -658.

［4］Obara S，Maruyama K，Ichikawa N，et al.Skin sensitization and photosensitization studies of hydrophobically modified hydroxypropylmethylcellulose in guinea pigs［J］.J Toxicol Sci，1998，23 Supp l 3：553-560.

［5］Draize J，Woodard G，Calvery H.Methods for the study of irritation and toxicity of substances app lied topically to the skin and mucous membrances［J］.Journal of Pharmacology And Experimental Therapeutics，1944（82）：377-390.

［6］Carraro C，Pathak M A.Studies on the nature of in vitro and in vivo photosensitization reactions by psoralens and porphyrins［J］.J Invest Dermatol，1988，90（3）：267-275.