不同品系小鼠在三種常見抑郁檢測方法中的行為學(xué)表現(xiàn)

李騰飛，孫秀萍，石 哲，高江暉，劉新民，劉華鋼

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西南寧 530021；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193； 3.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟南 250355）

本實驗選用常用的4種品系小鼠（C57BL/6、BALB/c、ICR和昆明）進行了三種行為學(xué)檢測，以期為急性應(yīng)激抑郁模型的品系選擇提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗儀器

空場計算機圖像實時檢測分析系統(tǒng)、懸尾計算機實時檢測分析系統(tǒng)均由中國航天員訓(xùn)練中心和中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所聯(lián)合研制開發(fā)。

1.2 實驗動物

C57BL/6、BALB/c、ICR和昆明小鼠各12只，SPF級，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供【SCXK（軍）2007-004】。4種小鼠均為雄性，健康，體重20～24 g，在塑料籠中分籠飼養(yǎng)。飼養(yǎng)房間（24～26）℃，采用12 h明，12 h暗循環(huán)照明，室內(nèi)環(huán)境安靜，小鼠自由獲得水和食物。動物適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后進行以下實驗（本實驗遵循實驗動物倫理原則）。

2 實驗方法

2.1 空場實驗

用空場實驗（open field test）［1］觀察小鼠進入新環(huán)境的自發(fā)活動特點，本實驗利用空場計算機圖像實時檢測分析系統(tǒng)進行測試。該空場測試箱為4個相同大小的具有一定斜度的桶組成，桶底面直徑30 cm，上口直徑34 cm，高40 cm。將4個圓桶置于封閉的空場實驗測試箱（80×80×150）cm中，測試箱內(nèi)部頂端安置兩組照明燈，內(nèi)部的光照強度為120 Lux，并且在測試箱頂部有內(nèi)置攝像頭，監(jiān)測動物的活動狀態(tài)并將動物的行為信息采集輸送至計算機系統(tǒng)［2］。實驗步驟如下：將小鼠放入空場活動測試箱的4個圓桶（桶內(nèi)中央半徑為7.5 cm的區(qū)域劃分為中央?yún)^(qū)）中，選擇空場實驗計算機圖像實時檢測分析系統(tǒng)中的抗抑郁模式，完成實驗參數(shù)設(shè)置，將實驗時間設(shè)置為30 min，進行亮度、幾何和照度標定后，選擇文件存貯路徑以保存實驗參數(shù)和實驗結(jié)果，鍵入開始命令后開始進行實驗。計算機自動記錄運動總路程、運動時間、平均速度、中央?yún)^(qū)的路程比率和時間比率等6個指標。同時人工記錄小鼠剛放進測試箱中5 min內(nèi)的直立次數(shù)（動物雙前肢同時離地，或者雙前肢放在桶壁上算作直立一次）。

2.2 小鼠懸尾實驗

懸尾實驗基于Steru等［3］建立的方法。將實驗動物尾部固定，使其頭部向下懸掛，動物在該環(huán)境中拼命掙扎，企圖擺脫困境，在經(jīng)過努力仍不能擺脫后，出現(xiàn)間斷性不動，顯示“行為絕望”狀態(tài)。該實驗采用懸尾計算機實時檢測分析處理系統(tǒng)進行測試。懸尾箱（72×36×16）cm采取四周封閉，頂面開放的形式，被分割成8個單元（18×18×16） cm，可以同時檢測8只動物。懸尾桿上固定著張力傳感器，其高度可通過與其相連的主桿旋鈕進行調(diào)節(jié)，滿足實驗操作需求。實驗步驟如下：打開懸尾采集分析軟件，完成實驗參數(shù)設(shè)置，將實驗時間設(shè)置于6 min，選擇文件存貯路徑以保存實驗參數(shù)；用膠布分別將8只小鼠尾端（約1 cm處）和特制小鉤對折粘在一起（小鼠呈倒懸體位且頭部距離箱底約5 cm），同時掛在懸尾箱上各自的張力傳感器上，立即鍵入開始命令后進行實驗，計算機自動記錄6 min內(nèi)小鼠的累計不動時間。

2.3 小鼠強迫游泳實驗

此實驗在Porsolt等人［4］建立的方法上做了一些改進。將動物單獨地放在柱狀塑料桶中（水深15 cm，直徑20 cm），水溫（25±1）℃。強迫游泳6 min，用秒表記錄后4 min內(nèi)小鼠的累積不動時間。（不動即“小鼠停止掙扎或呈漂浮狀態(tài)，四肢有輕微動作以保持頭部在水面”）。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗數(shù)據(jù)以均值±標準差的形式表示，各組間數(shù)據(jù)用t檢驗和單因素方差分析判斷其統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 空場實驗

實驗結(jié)果顯示：與C57BL/6小鼠相比較，BALB/c、ICR和昆明小鼠的運動總路程、運動總時間、平均速度、直立次數(shù)、中央?yún)^(qū)的路程比率和時間比率這5個指標均表現(xiàn)出顯著性差異（P＜0.05）。BALB/c、ICR和昆明小鼠的運動總路程、運動總時間、平均速度和直立次數(shù)顯著性高于C57BL/6小鼠。C57BL/6小鼠在中央?yún)^(qū)的運動路程、路程比率和時間比率也低于其他3種品系，并且與其他3種品系小鼠相比表現(xiàn)出差異顯著性（P＜0.05）。ICR和昆明小鼠在運動總路程、運動總時間、平均速度和直立次數(shù)這4個指標上也明顯高于BALB/c小鼠（P＜0.05），但是ICR和昆明小鼠的運動總路程、運動總時間、平均速度和直立次數(shù)這四個指標卻無統(tǒng)計學(xué)差異（表1和圖1）。

表1 四種不同品系小鼠自主活動的結(jié)果Tab.1 Results of open field test in the four species ofmice

3.2 懸尾實驗

圖1 四種不同品系小鼠的直立次數(shù)注：與C57BL/6比較，P＜0.05，＊＊P＜0.01：與BALB/c比較，#＜0.05，##P＜0.01。Fig.1 Number of rearing in the four species ofmiceNote：* P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with C57BL/6 mice；#＜0.05，##P＜0.01，compared with BALB/c mice.

C57BL/6小鼠的懸尾不動時間明顯高于BALB/c、ICR和昆明小鼠（P＜0.05），在與其他3種品系小鼠相比懸尾不動時間表現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)差異。BALB/c、ICR和昆明小鼠之間的懸尾不動時間差異無顯著性（圖2）。

3.3 強迫游泳實驗

與小鼠懸尾實驗結(jié)果不同的是，4種品系小鼠在強迫游泳實驗中的不動時間在統(tǒng)計學(xué)上無差異。但是C57BL/6小鼠不動時間的標準差比其他3種品系小鼠小，同時它的強迫游泳不動時間也略高于其他3種品系小鼠（圖3）。

4 討論

圖2 四種不同品系小鼠的懸尾實驗結(jié)果注：與C57BL/6比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01：與BALB/c比較，#P＜0.05，##P＜0.01。Fig.2 Results of tail suspension test in thefour species ofmiceNote：* P＜0.05，＊＊P＜0.01 compared with C57BL/6 mice； #P ＜0.05，##P＜0.01，compared with BALB/c mice.

圖3 四種不同品系小鼠的強迫游泳實驗結(jié)果Fig.3 Results f forced swimming tests in the four species ofmice

實驗小鼠在人類漫長的培育過程中已分化為多個品系如Swiss、ICR、DBA/2、BALB/c、C57BL/ 6［5］。其中C57BL/6和BALB/c小鼠是科學(xué)研究中常用而遺傳背景差異較大的兩個近交系［6］；ICR小鼠是國際著名的遠交群品系，其群體內(nèi)個體差異和在某些位點上的多態(tài)性非常符合遠交群實驗動物的特點；而昆明小鼠一直是我國特有的并且使用量最大的遠交群小鼠［7］。本實驗選用三種國際上常用的抑郁檢測方法對這四種品系小鼠進行行為學(xué)比較研究，以探討各自的行為特征。

空場實驗是在固定的區(qū)域內(nèi)對動物的自發(fā)活動指標進行觀察記錄，相對于操作性條件反射和急性應(yīng)激刺激，空場實驗對動物的影響最小，通常用于判斷動物的興奮或抑郁狀態(tài)，在鎮(zhèn)靜、抑郁和焦慮等神經(jīng)精神藥理研究領(lǐng)域內(nèi)廣泛運用［1］。本實驗采用計算機圖像實時分析檢測技術(shù)，動態(tài)分析動物在空場中的活動軌跡，可以提取客觀定量數(shù)據(jù)，擺脫了主觀的人工觀察方法，使實驗結(jié)果更加準確可靠［2］。實驗結(jié)果表明，C57BL/6小鼠在空場實驗中水平運動（運動路程、運動速度、運動時間）顯著低于其他3種品系的小鼠，水平運動少反映了動物的自發(fā)活動量低。由于嚙齒類動物有喜好靠邊活動的特性，中央?yún)^(qū)域?qū)儆诓黄珢鄣膮^(qū)域，中央?yún)^(qū)域活動頻率可以評價小鼠的探究行為［8］。在本實驗中C57BL/6小鼠在中央?yún)^(qū)的路程比率和時間比率均低于其他三種品系小鼠；另外，Edsbagge等［9］曾經(jīng)將直立行為也作為評價小鼠探索行為的指標，C57BL/6小鼠的直立次數(shù)顯著低于ICR和昆明小鼠（P＜0.01），但是略高于BALB/c小鼠。鑒于此，為了避免單一指標的局限，本實驗將中央?yún)^(qū)域活動頻率和直立行為進行綜合分析，從而說明C57BL/6小鼠對新奇環(huán)境的探索能力差。

小鼠懸尾和強迫游泳實驗是通過對動物施以無法逃避的應(yīng)激刺激造成動物的行為絕望（behavioral despair）而模擬人類的抑郁癥癥狀［10］，在行為藥理實驗中常用于抗抑郁藥物的快速篩選。在這兩種實驗中，小鼠最初表現(xiàn)為掙扎、試圖逃脫，一段時間過后小鼠放棄掙扎呈顯不動狀態(tài)，這反應(yīng)了小鼠“無助”的癥狀。實驗結(jié)果顯示，在這4種品系中C57BL/6小鼠的懸尾不動時間最長，與BALB/c、ICR和昆明小鼠相比差異表現(xiàn)出顯著性（P＜0.05），但是在強迫游泳實驗中四種品系小鼠的不動時間差異無顯著性，對上述結(jié)果綜合分析表明了C57BL/6小鼠在無法逃避的應(yīng)激刺激下易于造成行為絕望，其病理和生理機制有待于進一步深入研究。

綜上所述，在本實驗中近交系C57BL/6小鼠的自發(fā)活動量低，對新奇環(huán)境的探索能力差，在急性應(yīng)激刺激下容易造成行為絕望，因此C57BL/6小鼠可能更適合用于急性應(yīng)激抑郁模型。

［1］Walsh RN，Cummins RA.The open field test：a critical review［J］.Psychol Bull，1976，83：482-504.

［2］王瓊，劉新民，買文麗，等.自主活動實時測試分析處理系統(tǒng)的建立與開心散安神鎮(zhèn)靜作用驗證［J］.中草藥，2009，40（11）：1773-1779.

［3］Steru L，Chermat R，Thierry B，et al.The tail suspension test：a new method for screening antidepressants in mice［J］.Psychopharmacology（Berlin），1985，85：367.

［4］Porsolt RD，Anton G，Blavet N，et al.Behavioral despair in rats：a new model sensitive to antidepressant treatments［J］..Eur JPharmacol，1978，47：379.

［5］Joan S.Standardized Nomenclature for Inbred Strains of Mice：Eight Listing.Cancer Res，1985，45：945-977.

［6］Nomura T，Esaki K，Tomita T.CLASM anual for Genetic Monitoring of Inbred Mice［M］.University of Tokyo Press，1984：26-35.

［7］章根木，姚甘火.中國昆明小鼠（KM鼠）遺傳背景資料調(diào)查［J］.中國實驗動物學(xué)雜志，1997，4：246-251.

［8］Paulus M，Dulawa S，Ralph R，et al.Behavioral organization is independent of locomotor activity in 129 and C57 mouse strains［J］.Brain Res，1999，835（1）：27-36.

［9］Edsbagge J，Zhu S，Xiao MY，et al.Expression of dominant negative cadherin in the adult mouse brain modifies rearing behavior［J］.Mol Cell Neurosci，2004，25（3）：524-535.

［10］Borsini F，Voltera G，Meli A.Does the behavioral“despair”test measure“despair”?［J］.Physiol Behav，2003，38 （3）：385.