結核分枝桿菌感染小鼠的脾臟和肺臟組織荷菌量與病理變化

向志光，林樹柱，董 娜，袁 偉，徐艷峰，秦 川

（中國醫學科學院實驗動物研究所，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021）

結核病是由結核分枝桿菌感染引起的一類嚴重的傳染性疾病，全世界有大約三分之一的人口潛伏感染結核分枝桿菌，據世界衛生組織估計每年有約1 100萬人發展成為活動性結核，并有約180萬人死于結核病（WHO 2008年數據）。抗異煙肼、利福平等一線藥物的多耐藥菌的出現，使化學治療面臨新的困難，急需開發更為有效的抗結核藥物。結核菌動物感染模型是新抗結核藥物開發與評價中必不可少的工具。

在抗結核藥物的體內藥效學評價中，通過尾靜脈注射高劑量結核菌制備的小鼠結核急性感染模型較為常用［1］。但目前對于該感染模型中感染靶器官的組織荷菌量和病理早期動態變化的報道較少。本文報道了我們實驗室使用結核分枝桿菌標準株H37Rv，通過尾靜脈注射的方式感染雌性C57BL/6J小鼠，建立了小鼠結核菌急性感染模型，測定了小鼠感染后8周內不同時間點脾臟、肺臟組織的荷菌量以及病理變化。

1 材料和方法

1.1 實驗用菌株

結核分枝桿菌標準株H37Rv由中國藥品生物制品檢定所提供，菌號為93009。菌株經小鼠體內兩次增毒，于L/J斜面培養基（購自BD公司）培養，收獲斜面培養3周的細菌經5μm無菌濾器（Millipore公司）制成單細胞菌懸液，經L/J斜面培養基培養計數，單細胞懸液菌濃度為1.5×106CFU/m L，單細胞懸液分裝凍存于-80℃低溫冰箱備用。

1.2 實驗動物

實驗中使用的小鼠為6～8周齡的雌性C57BL/ 6J小鼠，SPF級，體重18～20 g，購自北京華阜康公司［SCXK（京）2009-0007］。實驗動物的使用得到了中國醫學科學院實驗動物研究所實驗動物使用和管理委員會的批準（批準號MC-09-2003），動物在感染前1周進入實驗動物研究所生物安全3級實驗室。

1.3 動物的感染與分組

取小鼠放于小鼠固定器中，暴露鼠尾，75％酒精擦拭鼠尾暴露鼠尾靜脈，尾靜脈注射200μL結核分枝桿菌H37Rv單細胞懸液，感染劑量為3×105CFU，共感染小鼠42只，于感染后1 d、1周、2周、3周、4周、6周、8周分別取6只動物脫頸處死，進行脾臟、肺臟組織荷菌量的檢測和病理分析。

1.4 組織荷菌量檢測

無菌取脾、肺組織，取左側肺組織和1/2的脾臟，先后經生理鹽水、4％硫酸和生理鹽水漂洗，加1 m L生理鹽水用玻璃勻漿器研磨，組織懸液經生理鹽水按照1∶10進行梯度稀釋，取10-2、10-3、10-4三個稀釋度的組織稀釋液100μL接L-J斜面，每個稀釋度平行接種3管，37℃培養3周后進行菌落計數。取每管菌落數5～100范圍內的稀釋度進行荷菌量統計。

1.5 病理分析

剩余的脾、肺組織置4％中性甲醛固定液中固定1周，組織修塊，脾臟組織按長軸橫切面進行修塊，肺組織沿肺門方向修塊。組織塊經梯度酒精脫水后石蠟包埋，切片厚度為4μm，經下行酒精梯度入水后行HE染色。按照每個切面的病灶類型、病灶大小和數量進行病理學分析和評分。

2 結果

2.1 感染動物脾臟和肺臟組織荷菌量的變化

感染動物在各時間點處死小鼠，脾臟、肺臟組織勻漿系列稀釋后經L-J斜面培養4周菌落計數。動物感染24 h后脾臟組織的荷菌量（Log10 CFU）為4.53±0.06，在小鼠感染1周、2周和3周后荷菌量達到5.79±0.03，5.91±0.45和6.58±0.08，荷菌量隨感染時間逐步增多。在4周后脾臟組織荷菌量維持相對穩定，4周、6周、8周荷菌量分別為6.67± 0.09、6.4±0.32、6.59±0.17。小鼠感染24 h和1周后肺臟組織稀釋100倍以上沒有檢測到結核菌。在2到8周肺臟組織荷菌量為3.68±0.43、4.49± 0.15、6.07±0.45、6.16±0.3、6.4±0.2，荷菌量逐步提高。圖1顯示感染小鼠結核分枝桿菌脾臟和肺臟組織的荷菌量變化。

2.2 感染小鼠組織病理變化

小鼠感染24 h后病理取材分析未發現脾臟和肺臟組織有明顯的病理變化（結果未顯示）。感染結核分枝桿菌1周后，肺臟血管周圍偶有炎性細胞浸出，炎性細胞以淋巴細胞為主，部分動物肺間質出現水腫（圖2B所示）；脾臟組織結構出現不規則，并可見淋巴細胞、單核細胞和中性粒細胞等炎性細胞的聚集（圖2F）。結核菌感染3周后小鼠肺組織血管和呼吸道周圍有大量的炎性細胞，并開始出現肉芽腫樣細胞聚集（圖2C）；脾臟組織結構紊亂，肉芽腫范圍較大，約占1/3面積，部分小鼠脾臟組織出現充血現象（圖2G）。結核菌感染6周動物肺臟出現大量肉芽腫（圖2D），脾臟組織充血現象較嚴重（圖2H）。結核菌感染8周肺臟組織肉芽腫面積和6周時相比稍有增多，大體解剖可見肺臟表面存在白色粟粒狀結節。結核菌感染8周脾臟病理表現和6周時無明顯差異（圖2見彩插4）。

注：圖中顯示小鼠感染結核分枝桿菌后不同時間點測定脾臟和肺臟組織荷菌量的對數值。在感染后1 d和1周時，肺臟組織沒有檢測出結核菌。圖1 小鼠感染結核菌脾肺組織荷菌量變化Note：Log10 CFU of bacteria Load of spleenand lung in M.tuberculosis infected mice at different time point.There was no TB detected in lung ofinfected mice at 1 day and 1 week.Fig.1 Changes of bacterial load in the spleen andlung in the M.tuberculosis infected mice

3 討論

結核感染動物模型在抗結核藥物的臨床前評價中具有重要作用，目前有多種動物被應用，包括小鼠、豚鼠、兔以及非人靈長類動物。雖然小鼠在感染結核分枝桿菌后的病理以及臨床表現和人類疾病的癥狀有較大差別，但由于其經濟性，小鼠的感染模型在新藥的藥效學評價上仍是首選的模型。

目前國際上流行的結核感染小鼠模型有多種，最早的結核感染小鼠模型是以高劑量的結核分枝桿菌通過尾靜脈注射血行感染動物，這一模型模擬了結核感染的血行擴散，最早在脾臟和肝臟等組織造成病理損傷［2］。上世紀末開始有人使用氣溶膠發生器通過呼吸道用較低劑量的結核分枝桿菌以氣溶膠的形式感染動物，該模型更好的模擬了病原體在人類的傳播方式，在動物首先造成了肺臟的感染，模擬了結核病早期肺結核的癥狀［3］。但是由于感染動物肺臟組織要在3～4周后組織荷菌量才可以維持相對穩定，造模需要的時間相對較長；在感染劑量上不同動物也存在著有差異的可能，這種模型也有一定的局限性。

不同品系的動物對于結核分枝桿菌的易感性存在差異，各個實驗室的得到的數據也不盡相同，有些實驗室使用遠交系小鼠［4］，更多的實驗室使用近交系小鼠［5］。DBA/2小鼠對于結核分枝桿菌抗性較弱，易死亡，表現為對結核分枝桿菌的易感；而C57和BAlB/c等品系的動物在感染結核分枝桿菌后不易死亡，相對不易感［6］。在抗結核藥物的藥效學評價中C57和BALB/c小鼠應用較多。

我們實驗室采用尾靜脈血行感染的方式以3× 105CFU的結核分枝桿菌H37Rv感染近交系小鼠C57BL/6J。過高的感染劑量可能引起感染動物過早死亡，不利于體內藥效學評價信息收集。感染后第二天脾臟即可檢出結核菌，脾臟組織的荷菌量隨時間逐漸增加，三周后達到較高的荷菌量，之后維持相對的穩定；肺臟中結核菌出現較晚，在感染后兩周有菌檢出，荷菌量隨時間不斷增加。感染一周后小鼠肺臟出現間質水腫和炎性細胞滲出，脾臟出現炎性細胞聚集；三周后肺、脾組織出現肉芽腫，并隨時間不斷增加數量，增大面積。這些結果表明該模型造成了動物的急性結核菌感染。由于實驗周期有限，本實驗未分析小鼠感染8周之后的情況。這種急性感染模型可以在感染早期用于抗結核受試物的藥效學評價。

［1］袁偉，秦川.結核病動物模型研究進展［J］.中國比較醫學雜志，2010，20（9）：55-59.

［2］Pierce C，Dubos RJ，Midd lebrook G.Infection of mice with mammalian tubercle bacilli grown in tween-albumin liquid medium［J］.JExp Med，1947，86（2）：159-174.

［3］Brian PK，Synthia KF，Michael TJ，et al.Low-dose aerosol infection model for testing drugs for efficacy against Mycobacterium tuberculosis［J］.Antimicrob Agents Chemother，1996，40（12）：2809-2812.

［4］Enrique JA，Janna LC，Michael HC.In vitro and in vivo activities of gatifloxacin against Mycobacterium tuberculosis［J］.Antimicrob Agents Chemother，2002，46（4）：1022-1025.

［5］Zhang T，Zhang M，Rosenthal IM，et al.Short-course therapy with daily rifapentine in a murine model of latent tuberculosis infection［J］.Am J Respir Crit Care Med，2009，180（11）：1151-1157.

［6］Medina E，North RJ.Resistance ranking of some common inbred mouse strains to Mycobacterium tuberculosis and relationship to major histocompatibility complex haplotype and Nramp1 genotype［J］.Immunology 1998，93：270-274.