高效液相色譜法測定冬蟲夏草口服液中腺苷

許 勇， 王 柯， 季 申

(上海市食品藥品檢驗所，上海201203)

冬蟲夏草口服液其處方由冬蟲夏草單方組成，具有補腎益肺、秘精益氣等功能。其主要活性成分之一腺苷是一種內源性嘌呤核苷，具有舒張血管、降低血壓、抑制血小板聚集、松弛血管平滑肌、鎮靜和抗驚厥等多種生理活性［1］。為控制藥品質量，保證臨床用藥的安全性和有效性，我們建立了用高效液相色譜法對制劑中冬蟲夏草的活性成分腺苷進行了測定。冬蟲夏草及其制劑中腺苷的測定方法文獻報道的主要為高效液相色譜法［2-4］。如其中冬蟲夏草藥材中腺苷的主要提取方法為用有機試劑超聲或回流提取后蒸干，溶劑定容后，利用高效液相色譜儀進樣分析。而冬蟲夏草口服液文獻報道的提取方法為用水、乙醚、水飽和的正丁醇依次萃取，正丁醇液蒸干，溶劑定容后，利用高效液相色譜儀進樣分析。方法均較為繁瑣、費時。而筆者是利用了口服液制劑中易干擾測定的多糖量較高，而多糖在被醇沉后，高速離心下容易沉淀的特點，建立了醇沉后離心的簡單易行的前處理方法，該方法準確、專屬性強，可有效地控制本品的質量。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測器(美國Agilent公司);Sartorius BS2202/CP225D型電子天平(德國Sartorius公司);腺苷對照品(中國藥品生物制品檢定所提供，批號879-200001);冬蟲夏草口服液(中華御醫堂養生文化研究院有限公司與上海御醫堂保健科技有限公司提供，批號 20080117、20080114、20080226);甲醇、乙腈均為色譜純(MERCK公司)，試劑均為分析純［中國醫藥(集團)上海化學試劑公司］。

2 方法與結果

2.1 檢測波長的選擇

取腺苷對照品溶液在200～400 nm進行紫外掃描，由光譜圖可見，腺苷對照品在260 nm波長處有最大吸收，故選擇260 nm作為檢測波長。

2.2 色譜條件與系統適應性試驗

色譜柱 Thermo ODS-HYPERSIL(0.46 cm ×20 cm，5 μm)色譜柱;流動相甲醇－0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(15∶85);體積流量1.0 mL/min;柱溫30℃;檢測波長:260 nm;進樣量10 μL。理論板數按腺苷峰計算應不低于5 000。

2.3 溶液的配制

2.3.1 對照品溶液的制備 取腺苷對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL含30 μg的溶液，即得。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密量取本品5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇3 mL，搖勻，放冷后，再加甲醇稀釋至刻度，搖勻，離心，取上清液，即得。

2.3.3 陰性對照溶液的制備 取缺冬蟲夏草的樣品按制備工藝制備冬蟲夏草口服液，按供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液。

2.4 方法專屬性考察

按上述色譜條件分別對對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液進行分析，結果無干擾。見圖1。

圖1 腺苷的高效液相色譜圖

2.5 方法學考察

2.5.1 線性關系考察 精密稱取腺苷對照品適量，加50%甲醇制成濃度分別為0.362 5 mg/mL的對照品溶液⑴與濃度為36.25 μg/mL的對照品溶液⑵。分別精密吸取對照品溶液⑴2、5、10 μL 和對照品溶液⑵1、2、5、10 μL 注入液相色譜儀，記錄峰面積。以進樣量(μg)為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，進行回歸分析。結果表明，腺苷在0.036 25 ～3.625 μg范圍內與峰面積值線性關系良好，回歸方程為:Y=3 093X+22.74，r=0.999。

2.5.2 精密度試驗 精密吸取36.25 μg/mL的腺苷對照品溶液10 μL，連續進樣6次，記錄峰面積，腺苷峰面積RSD值分別為0.11%，表明測定精密度良好。

2.5.3 重復性試驗 取同一冬蟲夏草口服液樣品(批號:20080117)，各一式6份，按2.3.2項下的方法分別制備供試品溶液，進樣測定。計算其RSD值為0.50%，表明測定重復性良好。

2.5.4 穩定性試驗 將供試品溶液(批號:20080117)于室溫下放置 0、4、6、9、18、24 h，進樣測定。計算得腺苷的峰面積的RSD值為1.5%，表明供試品溶液在24 h內化學性質穩定。

2.5.5 回收率試驗 精密量取已知量的樣品(批號:20080117)2.5 mL，一式9份，置10 mL量瓶中，以3份為1組，分別精密加入腺苷對照品溶液適量，制備供試品溶液，按色譜條件項下測定，計算平均回收率為101.4%，(RSD=0.91%)。

2.5.6 樣品測定 取 3樣品，批號分別為 20080117、20080114、20080226，分別按 2.3.2 項下的方法制備供試品溶液，進樣測定，以外標法計算質量濃度，結果分別為55、56、56 μg/mL。

3 討論

3.1 流動相的考察

對①甲醇-水(15∶85);②乙腈－0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(7∶93)和③甲醇－0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液(15∶85)3個流動相系統進行了考察。經試驗，流動相系統①得到的對照品色譜圖中，色譜峰脫尾嚴重，對稱性較差;流動相系統②得到的供試品色譜圖中，腺苷色譜峰雖然對稱性較好，但與其他色譜峰的分離度較差，沒有達到基線分離;流動相系統③得到的供試品色譜圖中，腺苷色譜峰較對稱，且與其他色譜峰均分離良好，故選擇流動相③用于檢測。

3.2 沉淀溶劑的選擇

冬蟲夏草口服液中含有大量的多糖，為了消除多糖對腺苷測定的影響，考慮用有機溶劑沉淀的方法。為有效對樣品進行凈化，對沉淀溶劑進行了考察，試驗中曾經選擇用乙醇和甲醇兩種有機試劑對糖進行沉淀。精密量取本品5 mL，置10 mL量瓶中，一式4份，以二份為一組，一組加甲醇稀釋至刻度，另一組加乙醇稀釋至刻度，分別搖勻，離心，取上清液進樣分析，結果(見表1)表明，乙醇在沉淀糖與雜質的時候，也將部分腺苷吸附下來，為保證凈化時不影響提取效率，最終選用甲醇作為沉淀溶劑。

表1 沉淀溶劑的考察

3.3 沉淀試劑加入量的選擇

為達到凈化效率最高且不影響提取效率，對凈化溶劑甲醇的加入量進行了考察，分別對樣品與甲醇的比例為7∶3;1∶1;1∶4，3種比例進行了考察。精密量取本品2、5、7 mL，分別置10mL量瓶中，一式兩份，分別加甲醇至刻度，搖勻，離心，取上清液進樣分析，結果(見表2)表明，樣品與甲醇比例為1∶1時，能有效去除雜質，且不影響腺苷被提出，故選擇精密量取樣品5 mL，加甲醇5 mL的凈化方法。

表2 甲醇加入量的考察

4 結論

冬蟲夏草藥材中腺苷的測定方法中國藥典2010年版一部也有收載［5］，本法與藥典的方法相比較，藥典是采用磷酸鹽緩沖溶液(pH6.5)［取0.01 mol/L磷酸二氫鈉68.5 mL與0.01 mol/L 磷酸氫二鈉31.5 mL，混合(pH 6.5)］-甲醇(17∶3)作為流動相系統，流動相的配制方法較為繁瑣、費時，而本法的流動相是采用甲醇－0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(15∶85)，配制方法較為簡便。且在前處理上，利用了口服液制劑多糖的特點，醇沉離心后直接進樣，使方法更加簡單易行。

［1］方和桂，康 洪.HPLC測定金水寶膠囊中腺苷的含量［J］.中國現代應用藥學雜志，2008，25(3):243-244.

［2］黃紅兵，江英橋.蟲草口服液的質量標準研究［J］.中成藥，1999，21(5):228-230.

［3］張振謙，馬月飛，黃永春.蟲草腺苷含量的快速測定［J］.廣西工學院學報，2007，18(3):4-7.

［4］夏文娟，曾曉英，袁海龍，等.不同產地冬蟲夏草腺苷含量測定［J］.中國中藥雜志，2001，26(8):540-542.

［5］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:106.