HPLC測定青藏高原不同地區藏藥手掌參中天麻素

薛 楠， 薛 敬， 林鵬程

(青海民族大學化生院，青海西寧 810007)

手掌參GymnadeniaconopseaR.Br.又名佛手參、手參、掌參，是蘭科Orchidaceae手參屬一種多年生草本植物，因其地下根莖形似手掌而得名，主要生長在青藏高原海拔2 700～4 000 m范圍內無污染的灌木叢中，為常用名貴藏藥［1-2］。手掌參味甘，性溫，具有增力生精、溫腎暖腎、大補元氣、安神增智等功效。尤其對陽痿、腎寒有益，具有很高的藥用價值，因而有“不老草”之稱［3-6］。天麻素是手掌參主要有效成分之一［7］，現代藥理研究表明，天麻素具有鎮痛、抗驚厥、抗衰老、增加心腦血流量、改善學習記憶力等作用［8］。為了有效控制藥材的質量［9］，本實驗建立了青藏高原不同地區手掌參中天麻素含量的高效液相色譜測定方法。該方法快速、簡便、準確、重復性好，不僅適用于手掌參原藥材的質量控制，還可供手掌參制劑借鑒。

1 儀器與材料

Agilent 1100高效液相色譜儀(配置手動進樣器，在線脫氣機，高壓二元梯度泵，恒溫柱溫箱，DAD檢測器，Agilent 1100色譜工作站);HH-4數顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司);FZ102微型植物試樣粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)。實驗用試劑甲醇為高效液相色譜專用試劑(山東禹王實業有限公司禹城化工廠);水為自制三重蒸餾水;磷酸為AR級(北京紅星化工廠);天麻素對照品由本課題組分離鑒定，純度大于99% 。手掌參樣品系2009年9月采于青藏高原不同地區，由青海民族大學藥學系林鵬程教授鑒定，樣品陰干后粉碎過80目篩，冷藏保存。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱 Hypersil ODS-2(4.6 mm ×250 mm，5 μm)柱;流動相甲醇-水(含0.04%的磷酸)=8∶92;體積流量1 mL/min;檢測波長222 nm;柱溫30℃，進樣量20 μL。該色譜條件下天麻素被洗脫且達到基線分離，保留時間為9.21 min(見圖1)。

2.2 溶液配制

精密稱取天麻素對照品3.50 mg置10 mL量瓶中，以甲醇溶解并定容，配制成對照品溶液。精密稱取手掌參樣品粉末1.0 g，加入50%的甲醇15 mL，熱回流提取2 h，抽濾，濾渣重復處理1次，合并濾液，濃縮后定容至25 mL量瓶中，過0.45 μm 濾膜，即得樣品溶液。

2.3 線性關系

精密量取天麻素對照品溶液適量，用甲醇準確稀釋成下列濃度:0.070、0.140、0.210、0.280、0.350 和0.420 g/L 的系列對照品稀釋液，取各稀釋液進樣20 μL，記錄峰面積。以峰面積(A)為縱坐標，進樣量C(μg)為橫坐標，得天麻素的回歸方程為:A=512.91C+0.35，r=0.999 9。線性范圍為:1.400 ～8.400 μg。當信噪比 S/N=3 時，天麻素的檢測限為0.32 ng。

圖1 天麻素對照品(A)和手掌參樣品(B)HPLC圖1.天麻素

2.4 精密度實驗

精密吸取濃度為0.210 g/L的天麻素對照品稀釋液20 μL，在2.1項色譜條件下重復進樣5次，記錄峰面積，計算RSD為0.41%(n=5)，表明儀器精密度良好。

2.5 重復性實驗

精密稱取手掌參樣品1.0 g共5份，分別按2.2項下方法制備成樣品溶液，然后在2.1項色譜條件下測定天麻素，計算得RSD為1.4%(n=5)，表明方法重復性良好。

2.6 穩定性實驗

取新配制的樣品溶液，分別在 0、2、4、6、8 h時進樣，測定天麻素的峰面積，計算得RSD為1.3%(n=5)，表明樣品溶液在8 h內穩定。

2.7 回收率實驗

精密稱取已測定的手掌參(3#樣品)1.0 g共9份，分為3組，每組3份，分別添加低、中、高3種濃度的天麻素對照品液適量，按2.2項下方法操作，測得天麻素平均回收率(n=9)為99.14%，RSD 為0.69%。結果見表1。

2.8 樣品測定

取2.2項下制備的青藏高原不同地區手掌參樣品溶液按2.1項色譜條件進行分析，經DAD檢測器驗證天麻素的峰純度后，按外標法以峰面積計算，得青藏高原不同地區手掌參樣品中天麻素的量(n=3)。結果見表2。

表1 天麻素回收率測定結果

表2 青藏高原不同地區手掌參中天麻素的測定

3 討論

3.1 樣品提取方法的確定［10］

考察冷浸、超聲和熱回流對手掌參中天麻素的量的影響，結果熱回流提取率最高。又分別以水、甲醇、乙醇為溶劑，考察不同溶劑對分析結果的影響，發現甲醇對天麻素提取率最高。利用正交試驗進一步考察不同濃度甲醇、不同溶劑量、不同提取時間和提取次數對天麻素的量的影響，方差分析結果表明，天麻素提取率的影響因素依次為:甲醇濃度＞提取時間＞溶劑量＞提取次數。考慮實際工作的方便、快捷，經進一步試驗，確定最佳提取方法為甲醇濃度50%，溶劑量15 mL，提取時間2 h，提取次數2次。

3.2 流動相的選擇

天麻素色譜峰易拖尾，經試驗，當在水中加入0.01% ～0.10%磷酸時可改善天麻素峰形。最終選擇甲醇和含0.04%的磷酸水溶液(8∶92)為流動相。

3.3 檢測波長的確定［11］

利用DAD檢測器在200～400 nm掃描對照品溶液的吸收光譜，結果在222 nm處有最大吸收，因此選擇該波長為檢測波長。

3.4 測定結果分析

青藏高原不同地區藏藥手掌參中天麻素測定的結果顯示，手掌參中天麻素質量分數在2.268～9.113 mg/g之間，含量有較大差異，其中以同德縣手掌參中天麻素中的量為最高。

［1］楊永昌.藏藥志［M］.西寧:青海人民出版社，1995:246.

［2］中國科學院西北高原生物研究所.青海植物志:第4卷［M］.西寧:青海人民出版社，1999:295-318.

［3］青海省藥品檢驗所，青海省藏醫藥研究所.中國藏藥:一卷［M］.上海:上海科學技術出版社，1996:341-344.

［4］李 敏，王春蘭，郭順星，等.手參屬植物化學成分及藥理活性研究進展［J］.中草藥，2006，37(8):1264-1268.

［5］覃筱燕，云妙英，唐 麗，等.藏藥旺拉的化學成分及藥理活性的研究進展［J］.中央民族大學學報:自然科學版，2007，16(3):229-232.

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［7］訾佳辰.手參的化學成分研究［D］.中國協和醫科大學，2008.

［8］何 晶.天麻素的藥理作用及臨床應用［J］.天津藥學，2006，18(5):62-63.

［9］楊蓓蓓，李 帥，張瑞萍，等.HPLC測定藏藥手掌參旺拉中4種有效成分的含量［J］.中國中藥雜志，2009，34(14):1819-1822.

［10］林鵬程，王永菊，祝存恩，等.青海不同地區藏藥麻花艽中環烯醚萜苷類成分的含量測定與品質評價［J］.中國藥學雜志，2006，41(10):783-785.

［11］伍振峰，何 偉，馬建春.天麻中天麻素含量測定方法改進的研究［J］.中成藥，2009，31(6):966-967.