大孔樹脂對金藍膠囊提取液的分離純化工藝研究

盛華剛， 朱立俏， 林桂濤

(山東中醫藥大學，山東濟南 250355)

金藍膠囊由金蕎麥、沙棘、絞股藍和腫節風組成，具有清熱解毒護陰，涼血活血止咳的功效，對肺癌具有較好的療效，現將其研制成新藥。在金藍膠囊的提取工藝研究中［1］，金蕎麥單獨提取，沙棘、絞股藍、腫節風三味藥材合并提取。對金蕎麥提取液采用大孔樹脂分離純化已進行了研究，取得了較好的效果［2］。大孔樹脂對單味藥的純化研究較多，對于復方制劑的研究較少，其純化應采用多成分指標進行研究［3-7］。本試驗以沙棘、絞股藍、腫節風三味藥材提取液中沙棘和腫節風中所含的總黃酮、絞股藍中的絞股藍皂苷、腫節風中的異秦皮啶為指標，進行大孔樹脂純化研究，從而為大孔樹脂用于中藥復方制劑的純化提供參考。

1 儀器、材料與藥材

LC-10A高效液相色譜儀(日本島津)，UV-754分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)。蘆丁對照品(100080-200306)，人參皂苷Rb1對照品(110704-200318)，異秦皮啶對照品(0837-200203)均購自中國藥品生物制品檢定所;所用試劑中乙腈為色譜純，其它為分析純;D-101、DA-201、DM-301大孔樹脂(天津海光化工有限公司)。沙棘、絞股藍、腫節風藥材購于濟南建聯中藥店，經山東中醫藥大學周鳳琴教授鑒定。

2 方法與結果

2.1 提取液和上樣藥液的制備

沙棘、絞股藍、腫節風三味藥材加70%乙醇，加熱回流提取2次，第1次加12倍量，第2次加8倍量，每次提取3 h，濾液回收乙醇，濃縮，加水定容至濃度為0.3 g生藥/mL，作為提取液。提取液以2 500 r/min離心10 min，收集離心液，沉淀加少量熱水混懸，再次離心，合并兩次離心液，調整濃度為0.3 g生藥/mL，作為上樣藥液。

2.2 大孔樹脂的預處理

試驗所采用的樹脂皆是醫藥級樹脂，不需用酸堿進行前處理，只需用95%乙醇浸泡至充分溶脹，再用蒸餾水沖洗至無醇味即可使用。

2.3 提取液和上樣藥液的成分測定［1］

2.3.1 總黃酮測定 標準曲線的制備:精密稱取蘆丁對照品10.18 mg，置25 mL量瓶中，加無水乙醇至刻度。精密吸取 0.25，0.75，1.5，3.0，6.0 mL 分別置 25 mL 量瓶中，加無水乙醇至6.0 mL，搖勻，分別加入1.0 mL 5% 亞硝酸鈉溶液，混勻，放置6 min，加入1.0 mL 10%硝酸鋁溶液，混勻，放置6 min，加入10.0 mL 10%NaOH 溶液，混勻，放置 15 min，加水至刻度，于500 nm處測定吸收度。回歸方程為Y=－0.003 51+0.011 15X(r=0.999 9)，蘆丁在 0.102 ～2.436 mg范圍內有良好的線性關系。

供試品溶液中總黃酮的測定:精密吸取供試品溶液10 mL，通過聚酰胺柱(50 ～80 目，2.5 g，ф1.5 cm)，先用 100 mL水洗脫，再用100 mL無水乙醇洗脫，收集無水乙醇洗脫液，蒸干，殘渣用無水乙醇定容至10 mL。精密吸取0.5 mL，按標準曲線項下操作測定含量。結果見表1。

2.3.2 絞股藍皂苷測定 標準曲線的制備:精密稱取人參皂苷Rb1對照品2.03 mg置1 mL量瓶中，加甲醇至刻度。精密吸取10，20，40，60，80，100 μl分別置 5 mL 量瓶中，熱風揮去溶劑，加0.2 mL 5%香草醛冰醋酸溶液，0.8 mL高氯酸，60℃水浴加熱15 min，取出，迅速用冷水冷卻，冰醋酸定容至刻度，放置30 min，于550 nm處測定吸收度。回歸方程為Y=0.008 18+0.021 18X(r=0.9993)，人參皂苷 Rb1在 4.06～40.6 μg/mL范圍內有良好的線性關系。

供試品溶液中絞股藍皂苷的測定:精密吸取供試品溶液10 mL，用乙醚提取至乙醚層無色，水層用同體積水飽和正丁醇提取6次，合并正丁醇提取液，蒸干，殘渣加10 mL水溶解，通過D-101大孔樹脂柱(1.5 cm×13 cm)，先用100 mL水洗脫，繼用100 mL 70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液，蒸干，殘渣用甲醇定容至5 mL。精密吸取50 μL，按標準曲線項下操作測定含量。結果見表1。

2.3.3 異秦皮啶含量測定 色譜條件:Kromasil C18色譜柱(5 μm、4.6 mm ×200 mm);流動相為乙腈 －0.1%磷酸溶液(20∶80);檢測波長為344 nm;體積流量為1.0 mL/min;溫度為室溫。

標準曲線的制備:精密稱取異秦皮啶對照品1.01 mg置10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度。精密吸取 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分別置5 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，各吸取20 μl進樣，以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，得回歸方程為Y=2 156+1 995 550X(r=0.999 9)，異秦皮啶在0.0404 ～0.404 μg范圍內有良好的線性關系。

供試品溶液中異秦皮啶的測定:精密吸取供試品溶液5 mL，用三氯甲烷提取5次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，殘渣用甲醇定容至10 mL，搖勻，注入液相色譜儀，測定含量。結果見表1。

表1 提取液和上樣藥液有效成分分析

2.4 大孔樹脂型號的確定

取D-101、DA-201、DM-301 3種型號的大孔樹脂各18 mL裝柱(ф1.5 cm ×10.5 cm)，量取 100 mL 上樣藥液通過樹脂柱，收集流出液;先用100 mL水洗脫，收集水洗脫液;再用100 mL 70%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，上柱體積流量和洗脫體積流量控制為0.5 mL/min。按2.3項下的方法測定流出液、水洗脫液和乙醇洗脫液中有效成分的量，計算3種型號樹脂的比吸附量和洗脫率。結果見表2。

表2 3種型號樹脂比吸附量和洗脫率比較

由表2可以看出，D-101大孔樹脂對總黃酮、絞股藍皂苷、異秦皮啶均有較好的吸附和洗脫效果，因此采用D-101大孔樹脂進行純化。

2.5 上樣工藝的研究

采用大孔樹脂純化過程中，藥液濃度、體積流量、pH值等因素會對成分的吸附產生影響［8］，無機鹽濃度會對總皂苷的吸附存在影響［9］，甚至是影響總皂苷大孔樹脂比吸附量的重要因素［10］，所以將無機鹽濃度也列為考察因素之一。因素水平見表3。

2.5.1 試驗方法 量取濃度為0.15 g生藥/mL的藥液160 mL，0.30 g生藥/mL 的藥液 80 mL，0.60 g生藥/mL 的藥液40 mL，通過 D-101 大孔樹脂柱(ф1.5 cm ×10.5 cm)，各因素水平按正交表中的設計操作，收集流出液;用100 mL水洗脫，體積流量為2 BV/h，收集水洗脫液。測定流出液、水洗脫液中有效成分的含量，以有效成分的比吸附量為指標，采用綜合評分法優選最佳上樣工藝。結果見表4。方差分析見表5。

表3 上樣工藝考察因素及水平

表4 上樣工藝考察L9(34)正交試驗

表5 方差分析

由結果可以看出:對有效成分比吸附量的影響因素依次排列為 C＞B＞D＞A，直觀分析的最佳上樣工藝為A3B1C1D1，但A因素中二、三水平相差不大，且三水平是由二水平濃縮制得，在濃縮的過程中會有少量沉淀產生，如再次離心會造成成分損失，直接上柱會影響流速，增加流速的控制難度。綜合以上分析，確定最佳上樣工藝為A2B1C1D1。即上樣藥液濃度為0.3 g生藥/mL，體積流量為2 BV/h，pH值為5.0，不加無機鹽。

2.5.2 上樣工藝驗證試驗 最佳上樣工藝試驗3次，結果總黃酮比吸附量為(6.85±0.45)mg/mL樹脂，絞股藍皂苷比吸附量為(18.44±0.12)mg/mL樹脂，異秦皮啶比吸附量為(359±3)μg/mL樹脂，說明最佳上樣工藝是可行的。通過驗證試驗可以確定上樣量與大孔樹脂量比例為總黃酮≤6.8 mg/mL樹脂，絞股藍皂苷≤18 mg/mL樹脂，異秦皮啶≤350 μg/mL樹脂。為了保證成分的有效吸附，防止泄漏現象的發生，依據上樣藥液中的有效成分含量，初步確定藥液上樣量為70 mL并對此進行試驗，結果有效成分未發生泄漏。

2.6 洗脫溶劑濃度的考察

取D-101 大孔樹脂18 mL(1.5 cm ×10.5 cm)，上樣藥液70 mL上柱，用100 mL水洗脫后分別采用30%、50%、70%、90%乙醇各150 mL洗脫，上柱和洗脫液體積流量皆為2 BV/h，收集乙醇洗脫液，測定有效成分，計算洗脫率。繪制不同乙醇濃度對有效成分洗脫率的曲線圖，結果見圖1。

由圖1可以看出，隨著乙醇濃度的增加，絞股藍皂苷洗脫率明顯增大，而總黃酮和異秦皮啶洗脫率增加很小。采用30%乙醇洗脫時，總黃酮洗脫率為88.03%，異秦皮啶洗脫率為93.95%，增加乙醇濃度對洗脫率影響很小;30%乙醇對絞股藍皂苷洗脫率為45.63%，隨著乙醇濃度的增加，洗脫率也增加，70%乙醇洗脫率為92.40%，再增加乙醇濃度，洗脫率幾乎不增加，該濃度與文獻［11］報道一致。綜合考慮各成分洗脫率和生產成本，洗脫溶劑確定為70%乙醇。

圖1 乙醇濃度對洗脫率的影響

2.7 洗脫溶劑用量的考察

上樣藥液上柱同2.6項下方法，先用100 mL水洗脫，繼以150 mL 70%乙醇洗脫，洗脫液體積流量為2 BV/h，洗脫液每25 mL收集1次。分別測定水洗脫液中浸膏量和70%乙醇洗脫液中有效成分含量。結果表明用水量達到75 mL(約為樹脂體積的4倍)時洗脫液中固形物已經很少，故水的用量確定為樹脂體積的4倍;70%乙醇用量達到100 mL(約為樹脂體積的6倍)時，洗脫液中有效成分已呈微量，所以70%乙醇的用量確定為樹脂體積的6倍。

2.8 大孔樹脂純化工藝驗證試驗

上樣藥液上柱同2.6項下方法，先以樹脂體積4倍量的水洗脫，繼以樹脂體積6倍量的70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液，洗脫液流速為2 BV/h，測定純化前后干膏率及有效成分含量，計算純化前后干膏中有效成分含量和純化后有效成分收率。結果見表6。

表6 純化前后比較和有效成分收率(n=3)

由表6可知:(1)三藥合提藥液純化后干膏率為純化前的16.61%，經過大孔樹脂純化后干膏率明顯下降;(2)純化后干膏中有效成分含量明顯提高且有較高的收率，有效成分損失較少。試驗說明D-101大孔樹脂對金藍膠囊提取液中的總黃酮、絞股藍皂苷、異秦皮啶皆有較好的純化作用，所確定的純化工藝是合理的。

3 討論

3.1 影響大孔樹脂純化效果的因素有很多，如大孔樹脂的結構、被純化成分的性質、上柱前藥液的理化性質(包括藥液的濃度、溫度、酸堿度、無機鹽濃度、黏度等)、吸附時的溫度、上柱及洗脫時的體積流量、洗脫劑的種類及用量、樹脂柱的徑高比等。試驗中僅對部分影響因素進行了考察，其它因素有待于以后進一步研究。

3.2 大孔樹脂能富集、分離不同母核結構的藥物，可用于單味藥材或復方制劑中有效成分的分離與純化，但大孔樹脂型號眾多，性能用途各異，而中藥成分又極其復雜，尤其是復方制劑，首先應根據功能主治明確其有效成分的類別和性質，再通過試驗確定對各有效成分皆具有較好吸附和洗脫能力的大孔樹脂。

［1］盛華剛，林桂濤，徐桂紅.金藍膠囊提取工藝的研究［J］.山東中醫藥大學學報，2006，30(2):148.

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