北豆根中蝙蝠葛堿的穩定性研究

劉全宇， 劉文義

(1.黑龍江省獸藥飼料監察所，黑龍江 哈爾濱 150069;2.佳木斯大學附屬第一醫院腫瘤科，黑龍江 佳木斯 154000)

北豆根為防己科植物蝙蝠葛Menispermum dauriccmD的干燥根莖，始載于《中國藥植志》［1］，苦，寒，歸肺、胃、大腸經。清熱解毒，祛風止痛。主要成分為生物堿，約1%以上［2］。其總堿具有祛痰鎮咳作用［3］，制劑臨床上常用于治療咽喉炎。現代藥理學研究發現其中的酚性總堿和蝙蝠葛堿(Dauricine)對腦梗塞和心肌缺血有良好的治療作用［4］，梁文杰等［5］證實北豆根的醇提物，主要成分為蝙蝠葛堿，對人紅白血病細胞株、人胃癌細胞株及TE13腫瘤細胞的增殖反應均有明顯的抑制作用，且對腫瘤組織原代培養細胞增殖反應具抑制作用。在開發新藥研究上，有很好的利用價值。

蝙蝠葛堿為雙芐基異喹啉類結構，白色粉末，研究中發現，其化學成分穩定性較差，光照或室溫長時間放置后均變黃，受外界環境的物理和化學因素影響而發生含量下降成分降解的現象?？偵飰A中雙芐基異喹啉類生物堿量最高［6］，作為主要的活性成分，其穩定性直接影響了制劑的性質。王楠等［7］對北豆根酚性總堿粉針劑中蝙蝠葛堿量進行了室溫下3個月的初步穩定性考察。通過HPLC法測定，3個月內總堿中蝙蝠葛堿的質量分數在70%左右。在劇烈還原條件下，雙芐基異喹啉類生物堿雜環可發生裂環反應生成季銨鹽［8］。陳勇等［9］在對北豆根生物堿的質譜研究中，發現雙芐基異喹啉類生物堿亦可氧化開環并失去N甲基而生成季銨鹽。在雙芐基異喹啉生物堿氧原子的研究中發現，某些生物堿中含有酚羥基，在酸堿條件下，如遇到酸酐、酰氯及羧酸等?；瘎┳饔?，可得O-?；铮?0］。

穩定性研究目的是考察原料藥或制劑的性質在溫度、濕度、光線等條件的影響下隨時間變化的規律，為藥品的生產、包裝、貯存、運輸條件和有效期的確定提供科學依據，以保障臨床用藥安全有效［11］。本試驗對蝙蝠葛堿單體的溫度，光照等因素進行探討。

1 方法學考察

1.1 儀器、試劑和樣品

LC-2010型HPLC(日本島津);真空恒溫干燥箱;紫外燈;乙腈、甲醇為色譜純;三乙胺、磷酸為分析純;蝙蝠葛堿對照品(純度99.15%)，蝙蝠葛堿供試品均為實驗室自制。

1.2 色譜條件 色譜柱:ODS-C18柱(Hypersil ODS2，4.6 mm×150 mm，5 μm);流動相緩沖液(將 0.68 mL 磷酸和0.71 mL的三乙胺加純凈水至500 mL，過0.45 μm水系微孔濾膜)-乙腈(76∶24);檢測波長281 nm;柱溫40℃;體積流量1.0 mL/min;進樣量 10 μL［4］。

1.3 對照品溶液的制備 精密稱取蝙蝠葛堿對照品0.012 6 g置于50 mL量瓶中，加緩沖液超聲20 min溶解并稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm水系微孔濾膜，配成質量濃度為0.252 0 mg/mL的對照品溶液。

1.4 線性關系 取對照品溶液分別進樣2、4、6、8、10 μL，按上述色譜條件測定峰面積，以進樣量(質量)為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標繪制標準曲線。得回歸方程為Y=382 796X－21 727，r=0.999 9。表明蝙蝠葛堿在 0.504 0 ～2.520 0 mg質量范圍內呈線性關系。

1.5 精密度試驗 取上述對照品溶液，按上述色譜條件重復進樣5次，其峰面積的積分值。RSD為0.18%，表明試驗設備精密度良好。

1.6 重復性試驗 取同一批樣品的5個試樣按1.3項下方法制備供試品溶液，平行測定，記錄峰面積值，RSD為1.05%，表明樣品測定方法重現性良好。

1.7 穩定性試驗 按1.3項下方法制備供試品溶液，取同一供試品溶液，每隔2 h測定1次，測定5次。記錄其峰面積的積分值，RSD為0.36%，表明10 h內該測定方法穩定可靠。

1.8 回收率試驗 取已知濃度的供試品溶液，精密稱定5份，分別加入蝙蝠葛堿對照品10 mL(相當于2.520 0㎎)量瓶中，加緩沖液超聲20 min溶解并稀釋至刻度，搖勻，按樣品測定方法測定，計算回收率，5份樣品平均回收率為99.99%，RSD為0.37%(n=5)，回收率較高方法可靠。

2 溫度對蝙蝠葛堿的影響

采用經典法(恒溫加速試驗法)，將蝙蝠葛堿適量分別放置于40、60、80、100℃的恒溫箱中進行加速試驗，每隔5 d取樣進行定量分析。稱取每批樣品約5 mg置于50 mL量瓶中，加緩沖液超聲20 min溶解并稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm水系微孔濾膜。使用1.2項下HPLC法測定。見表1～2。

表1 不同時間和不同溫度條件下蝙蝠葛堿的測定結果

將上述數據以lgC對反應時間t作回歸方程，符合方程:lgC=－K/2.303t+lgC0。可確定蝙蝠葛堿隨時間，溫度變化符合一級降解反應。求得各溫度點的K值及lgK。

表2 不同溫度條件下蝙蝠葛堿穩定性參數

蝙蝠葛堿的降解速率常數隨溫度增大而逐漸增大，根據Arrhenius公式:得 lgK= －2 622.6/T+4.973 1，r=0.957 5。外推得K25℃=1.502 6 × 10－4，K0.925℃=0.105 4/0.000 150 264≈701.4(d)=1.92(年)。表明在25℃室溫條件下蝙蝠葛堿下降1 0%需要大約1.92年。

3 光照對蝙蝠葛堿單體的影響

將蝙蝠葛堿適量分別放置于避光陰涼處、4 500lx光強度的日光燈光照箱及365 nm紫外燈照射下，每隔5 d取樣進行定量分析。稱取每批樣品約5 mg置于50 mL量瓶中，加緩沖液超聲20 min溶解并稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm水系微孔濾膜。使用1.2項下HPLC法測定。見表3，圖1。

表3 光照因素下蝙蝠葛堿的測定結果

避光陰涼條件下:lgC= －6.397 5×10－5t+2，‘r=0.999 4，K=1.473 3 × 10－4，K0.9=715.4。日光光照箱下:lgC= －1.987 6 ×10－4t+2，r=0.995 6，K=4.577 4 × 10－4，K0.9=230.3。365 nm 紫外光條件下:lgC= －3.344 1 ×10－4t+2，r=0.999 1，K=7.701 5 ×10－4，K0.9=136.9。

蝙蝠葛堿變化速率K紫外光＞K日光＞K避光。光因素影響明顯。

圖1 蝙蝠葛堿穩定性色譜圖

4 討論

藥物的穩定性包括物理穩定性、生物穩定性和化學穩定性。蝙蝠葛堿由兩個芐基異喹啉類結構通過醚鍵連接，含有酚羥基與N原子，為酚性生物堿。單體長時間放置或經歷高溫光照等因素后，顏色由白色轉向淡黃色，含量下降。對其化學穩定性進行探討，蝙蝠葛堿單體在室溫條件下t0.9大約1.92年，比較穩定。隨著溫度增加，其變化速率加快，以lgC對t做圖，|r|均大于0.99，線性良好，表明蝙蝠葛堿降解規律均符合一級動力學方程。

由于吸收給定波長的光子往往是分子中某個基團的性質，所以光化學提供了使分子中某特定位置發生反應的最佳手段［12］。蝙蝠葛堿結構中有苯環的不飽和共軛體系與酚羥基，既有發色團又有助色團。本試驗在HPLC上發現，隨著光照時間的延長，蝙蝠葛堿含量降低，兩側出現小的雜質峰，推測其在光照條件下分解成其他成分。本試驗以考察蝙蝠葛堿單體的含量變化出發，根據2010年《中國藥典》［13］規定，光強化試驗應以裝有日光燈的光照箱，光強度以4500lx±500lx的條件下第5、10天取樣檢測。本試驗選擇避光、450 0lx日光光照箱及365 nm紫外燈條件對蝙蝠葛堿，每隔5 d取樣測定至30 d，結合試驗數據得出蝙蝠葛堿在避光、日光以及紫外燈情況下降解均符合合一級動力學方程。蝙蝠葛堿單體光因素下不穩定，應保存在避光陰涼處。

［1］高學敏.中藥學［M］.1版.北京:人民衛生出版社，2000:532-533.

［2］方立瓊.中藥山豆根與北豆根的質量評價［J］.上海醫科大學學報，1992，19(2):124-128.

［3］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2005年版一部［S］.北京:化學工業出版社，2005:65.

［4］蘇云明，李永強，周 瑗.蝙蝠葛酚性堿對實驗性心肌缺血保護作用的研究［J］.中國藥師，2002，5(6):326-328.

［5］梁文杰.中藥北豆根提取物抗腫瘤抗突變及免疫學調節作用的實驗研究［D］.石家莊:河北醫科大學.2004:17.

［6］徐國鈞，徐珞珊，何宏賢，等.中國藥材學［M］.北京:中國醫藥科技出版社，1996:481.

［7］王 棟，王 楠，劉 巖，等.HPLC法測定北豆根總堿粉針劑中蝙蝠葛堿質量分數［J］.中醫藥學報，2006，34(1):8-9.

［8］Everette A J，Lowe L A，Wilkinson S.Revision of the structures of(+)-tubcurarine chloride and(+)-chondrocurine［J］.J Chem Soc D，1970，12(5):1020.

［9］陳 勇，陳懷俠.北豆根生物堿電噴霧質譜電離規律及其特征圖譜研究［J］.分析化學研究簡報，2006，34(5):675-678.

［10］Ogino T，Sato T，Ataski H，et al.Four new bisbenzylisoquinoline alkaloids from root of Stephania tetrandra［J］.Heterocycles，1988，27(5):1149.

［11］國家食品藥品監督管理局注冊司.化學藥物穩定性研究的技術指導原則［S］.2005:1.

［12］格里菲思著.侯毓汾，吳祖望，胡家振等譯.顏色與有機化學結構［M］.北京:化學工業出版社，1985:84-251.

［13］國家藥典委員會.中國人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:附錄XIXD.