胰島素抵抗對大鼠腦海馬區Aβ蛋白表達的影響及認知行為學的改變

呂愛紅 朱帥科 張曉曼

鄭州市第一人民醫院 鄭州 450004

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是以學習、記憶等認知功能下降為臨床特征的神經系統變性疾病,β-淀粉樣蛋白(β-amyloid,Aβ)沉積是 AD的主要病理學特征。較多研究證實2型糖尿病影響認知功能,而AD被認為是一種3型糖尿病[1]。胰島素抵抗是2型糖尿病病理機制之一,本實驗通過觀察胰島素抵抗大鼠腦海馬區Aβ的表達及認知功能的改變,旨在探討胰島素抵抗與AD的關系,為AD的發病機制提供一定的基礎理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 4～5周齡清潔級健康雄性Wistar大鼠30只,體質量180～200 g,購于鄭州大學實驗動物中心。兔 Aβ40一抗(購于武漢博士德生物工程有限公司),辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(購自北京中杉金橋生物技術有限公司),血糖儀(美國強生公司產品),Morris水迷宮(北京碩林苑科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型制備和分組：將30只Wistar雄性大鼠,按照隨機數字表法分組,每組15只。正常對照組(NC組)給予標準嚙齒類動物飼料喂養,模型組給予高糖高脂飼料喂養(飼料成分：10%豬油,20%蔗糖,2.5%膽固醇,1%膽酸鹽,6.5%常規飼料),誘導出胰島素抵抗模型。

1.2.2 Morris水迷宮實驗：水迷宮為一個不銹鋼圓形水池,直徑100 cm,高 60 cm,內置無色有機玻璃平臺,平臺高40 cm,在水池壁東西南北部位分別標明入水點。將平臺放在西南象限正中處,迷宮中含牛奶液面高于安全平臺1 cm,水溫(22±1)℃,加適量奶粉使水呈乳白色,實驗期間環境安靜,迷宮外參照物不變。該實驗歷時5 d,每天上下午2個時間段,每個時間段訓練4次,每次訓練隨機找個入水點,將大鼠面向池壁放入水池,同一次訓練所有大鼠入水點相同,記錄大鼠從入水找到平臺的時間即逃避潛伏期。如果大鼠在120 s內沒有找到平臺,將其引向平臺,潛伏期計為120 s。前4 d為訓練期,第5天進行測試。

1.2.3 一般指標的測定：從大鼠尾靜脈取血,用血糖儀檢測血糖。大鼠處死前心臟取血1 mL,離心留取血漿,用放射免疫法檢測胰島素。胰島素抵抗指數是以穩態模型的胰島素抵抗指數 HOMA-IR=FINS(IU/L)×FPG(mmol/L)/22.5表示。

1.2.4 組織標本及切片制備：水迷宮實驗結束后,用10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉后,開胸暴露心臟,用生理鹽水100 mL灌洗左心室,可見清涼液體從已剪開的右心耳流出,用4%多聚甲醛固定后,斷頭取腦。冠狀位切取視交叉后1～4 mm的腦組織。

1.2.5 免疫組化檢測Aβ40的表達：石蠟切片常規脫蠟,脫水,枸櫞酸鹽(p H 6.0)抗原修復液中熱修復 15 min,自然降到室溫。3%H2O2孵育15 min。山羊血清封閉切片,加入一抗Aβ40(1∶100),4℃過夜,二抗及SP試劑,用PBS代替一抗作陰性對照,未出現陽性反應,各步驟均以PBS沖洗。DAB顯色,蘇木素復染,逐層脫水,中性樹膠封片。每只大鼠取5張切片,在200倍光學顯微鏡下進行半定量分析,將每張切片隨機攝取5個視野,圖像采集后用Image-Pro Plus 6.0分析軟件測定陽性物質的平均光密度值。

1.3 統計學處理 采用SPASS 13.0統計學軟件行t檢驗,實驗數據以±s表示,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 空腹血糖、胰島素水平及胰島素抵抗指數 IR組大鼠胰島素水平(28.8±2.8)IU/L,胰島素抵抗指數5.15±0.38,顯著高于NC組(13.2±3.7,2.17±0.24),差異有統計學意義(P＜0.01),而 IR組空腹血糖(5.47±0.34)較 NC組(5.59±0.36)略增高,組間比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

2.2 Morris水迷宮實驗成績 與NC組的(30.61±10.8)s相比,IR組大鼠逃避潛伏期(78.56±9.1)s明顯延長(P＜0.01)。

2.3 Aβ40蛋白表達結果 鏡下觀察可見 Aβ40蛋白的陽性表達物為棕黃色沉著物。NC組大鼠海馬區神經元著色較淺,神經元細胞排列密集,表達呈弱陽性;與NC組相比,神經元細胞排列稀疏,IR組呈深棕黃色,染色較深,表達呈強陽性。2組Aβ40蛋白平均光密度值差異有統計學意義(P＜0.01)。

3 討論

胰島素抵抗是指胰島素維持正常血糖能力下降的現象,臨床特征為高胰島素血癥,但尚未發展至2型糖尿病階段。高脂高糖飲食誘導的胰島素抵抗模型更接近人類的發病機制,本研究通過喂養大鼠高脂高糖飲食12周后檢測2組大鼠血糖水平,差異無統計學意義,而IR組大鼠血漿胰島素水平、胰島素抵抗指數較正常對照組增高,差異具有統計學意義,表明胰島素抵抗模型建立成功。本實驗中采用Morris水迷宮實驗觀察大鼠的認知行為改變,與對照組相比,胰島素抵抗組大鼠逃避潛伏期延長,提示胰島素抵抗大鼠學習和記憶能力下降。有研究證實胰島素、胰島素受體及胰島素敏感的葡萄糖轉運蛋白選擇性分布于腦內認知功能區,如海馬區,胰島素參與調節學習和記憶功能,在大鼠腦室內注射胰島素能夠提高大鼠的被動逃避能力,給AD患者靜脈內注射胰島素能改善記憶功能,因此,本研究胰島素抵抗大鼠的認知功能下降,推測胰島素的相對缺乏是導致認知功能下降的主要因素。

在AD發病過程中,Aβ是由 APP先后被β,γ-分泌酶先后裂解而產生,本實驗應用免疫組織化學染色法檢測2組大鼠腦內Aβ40蛋白表達,結果顯示,Aβ40在正常組大鼠腦組織有少量表達,與正常組相比,IR組大鼠海馬區Aβ40蛋白的表達均較對照組明顯增多(P＜0.01)。海馬區是與認知功能最密切的一個部位,目前,Aβ確切的功能尚不清楚,有實驗證實,不同濃度的Aβ對神經元的影響不同,低濃度的Aβ對神經元有營養作用,高濃度的Aβ對神經元有神經毒性,使樹突和軸突退縮,導致神經元減少或缺失,繼而引起學習、記憶功能下降等臨床癥狀[2]。在生理情況下,細胞漿內高爾基體和內質網運輸Aβ到細胞外,當發生胰島素抵抗時神經元細胞內糖代謝發生異常,ATP生成減少,引起神經元細胞胞漿內內質網和高爾基體功能下降,繼而導致β-淀粉樣蛋白在胞漿內過度沉積[3]。

綜上所述,本實驗從分子生物學證實胰島素抵抗能導致認知功能下降,同時發現Aβ蛋白表達增加,因此,胰島素抵抗可能參與了AD的發生與發展。

[1]Lester-Coll N,Rivera EJ,Soscia SJ,et al.Intracerebral streptozotocin model of type 3 diabetes：relevance to sporadic Alzheimer＇s disease[J].J Alzheimers Dis,2006,9(1)：13-33.

[2]Calabrese EJ.Amyloid beta-peptide：biphasic dose resp onses[J].Crit Rev Toxical,2001,31(4/5)：605-606.

[3]褚文政,錢采韻.側腦室注射鏈脲霉素引起大鼠腦Aβ1-40和Aβ1-42表達增加[J]. 第四軍醫大學報,2005,26(15)：1 356-1 358.