羅格列酮對人結腸癌細胞HT-29生長的影響

陳艷華

結腸癌是常見的惡性腫瘤之一，目前主要的治療方法是手術和化療。但是對于晚期結腸癌，無法手術，化療療效欠佳，尋求高效、低毒的化療藥物迫在眉睫。羅格列酮（Rosiglitazone，ROZ）為過氧化物酶體增殖因子活化受體（Peroxisome proliferator activated receptors，PPARs）的合成配體，是一類新的抗糖尿病藥物。近年研究表明，ROZ可以通過誘導多種腫瘤細胞分化、凋亡來抑制腫瘤細胞生長，如乳腺癌、前列腺癌、非小細胞肺癌[1-3]。本實驗旨在探討ROZ對人結腸癌細胞HT-29生長抑制和誘導凋亡作用。

1 試劑與方法

1.1 藥品與試劑 ROZ由浙江萬馬公司提供。用DMSO配成5mmol/l抽濾滅菌后-20℃貯存備用。5氟尿嘧啶購自浙江海門制藥廠，用PBS配成1g/L，-20℃貯存備用。MTT（四氮甲基四唑藍）均為Sigma產品。小牛血清為杭州四季青產品。RPMI-1640購自GIBCOBRL公司。

1.2 細胞與細胞培養 人結腸癌細胞HT-29由中國典型培養物中心引進，用10％小牛血清的RPMI-1640培養基，在37℃，5％CO2溫箱中培養。取對數生長期細胞用于實驗。

1.3 MTT法檢測ROZ對腫瘤細胞增殖的影響 取對數生長期細胞制成4×105/ml單個細胞的細胞的懸液接種于96孔培養板中，每孔100μl，含細胞數4×104/ml，置入37℃，5％CO2培養箱中培養2h，給藥組每孔加入100ul藥液。調零組和對照組加入相同體積PBS，每組設3個平行孔。培養72h后每孔加入用PBS配制的MTT（5μg/L）20μl（調零組除外），再培養4h，棄去培養液，加入二甲基亞砜（DMSO）100μl/孔。待甲瓚完全溶解后用EXL-800UV全自動酶聯免疫儀在波長570nm處調零后讀取吸光度A值。取3孔的均數，按公式細胞生長抑制率（IR）=（1-試驗孔A值/對照孔A均值）×100％，計算IR值，以上實驗重復4次。

表1 MTT比色法測定ROZ對HT-29細胞增殖活性的作用（SD，n＝4，72h）

表2 流式細胞儀檢測ROZ對HT-29細胞凋亡的影響±s n=3）

表2 流式細胞儀檢測ROZ對HT-29細胞凋亡的影響±s n=3）

注：*與對照組比較P＜0.05，#與25μmol/LROZ組比較，P＜0.05，△與12.0μg/mL5-FU比較P＜0.05

分組 藥物濃度（μmol/L） 凋亡率（％）空白對照組 0 1.82±0.26 5-FU 12.0μg/mL 31.06±0.99* ROZ組 25 8.36±0.21* 50 21.2±0.69*# 100 41.6±1.56*#△

2 結果

2.1 MTT比色法測定ROZ、5-Fu對HT-29細胞增殖活性的影響用0.6、5.0、25.0、50.0、100.0μmol/LROZ處理細胞72h，其對HT-29細胞的抑制率分別是5.25％，8.69％，12.98％，31.02％，55.68％，呈藥物濃度依賴方式，但ROZ 50μmol/L及以下濃度時，HT-29細胞增殖和相對抑制率小于20％，提示此濃度范圍的ROZ無細胞毒性。當用12.0μg/ml氟尿嘧啶處理細胞72h，其對HT-29細胞的抑制率56.58％。ROZ對HT-29細胞增殖抑制的IC50為136.1μmol/L；表明ROZ具有抑制HT-29細胞作用。100μmol/LROZ與陽性藥物12.0μg/ml氟尿嘧啶比較抑制作用接近（見表1）。

2.2 ROZ、5-Fu對HT-29細胞凋亡的影響

ROZ對細胞凋亡的影響，流式細胞術顯示HT-29細胞的自然凋亡率為（1.82±0.26）％，25.0μmol/L的ROZ與細胞作用72h后，細胞凋亡率為（8.36±0.21）％，提示25.0μmol/L的ROZ并不誘導細胞凋亡。50，100μmol/L的ROZ作用HT-29細胞凋亡率增加至21.2％，41.6％，與空白對照組相比，差異有統計學意義，其凋亡率均有增加（見表2）。

3 討論

PPARs是一組具有復雜功能的核受體超家族成員。PPARs與脂肪形成、糖代謝、炎癥及腫瘤發生等多種生物過程有關。ROZ為一種噻唑烷二酮類藥物，是PPARγ的人工合成配體。近年來研究發現[4-5]，PPARγ在多種腫瘤細胞如乳腺癌，前列腺癌，肺癌，急性白血病等表達，噻唑烷二酮類藥物處理上述細胞，可通過誘導分化和（或）凋亡來抑制腫瘤細胞生長。

ROZ人體血藥峰值濃度為1.67μmol/L。本實驗MTT及用流式細胞術結果顯示，低濃度（0.6、5.0、25.0μmol/L）ROZ對HT-29細胞增殖和相對抑制率小于20％，提示此濃度范圍的ROZ無細胞毒性。50、100μmol/L ROZ體外可抑制HT-29細胞生長，本實驗流式細胞術100μmol/L的ROZ作用HT-29細胞凋亡率增加至41.6％，誘導HT-29細胞凋亡。提示ROZ能抑制HT-29細胞生長，誘導細胞凋亡的濃度較高，單用ROZ體內血藥濃度難以達到抗腫瘤作用，可能需要通過與化療藥物合用降低化療藥物劑量，從而減少化療藥物的副作用、減少耐藥性而達到抗腫瘤作用。這為研發化療增敏藥物提供很好的實驗依據。

[1]Liu H,Zang C,Fenner MH,et al.PPARgamma ligands and ATRA inhibit the invasion of human breast cancer cells in vitro[J].B reast Cancer Res Treat,2003,79（1）：63-74.

[2]Xu Y,Iyengar S,Roberts RL,et al.Primary culture model of peroxisome proliferator-activated receptor gamma activity in prostate cancer cells[J].J Cell Physiol,2003,196（1）：131-143.

[3]Tsubouchi Y,Sano H,Kawahito Y,et al.Inhibition of human lung cancer cell growth by the peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists through induction of apoptosis[J].Biochem Biophys Res Commun，2000,270（2）：400-405.

[4]Chang TH,Szabo E.Induction of differentiation and apoptosis by ligands of peroxisome proliferator-activated receptor gamma in non-small cell lung cancer[J].Cancer Res,2000,60（4）：1129-1138.

[5]戴文香,王莉,陳艷華,等.羅格列酮抗人HL-60細胞增生作用及其作用機制[J].醫學研究雜志,2009,38（6）：20-24,136.