丹參酮ⅡA對Lewis肺癌小鼠Bcl-2及Bax表達的影響

李春娣 張薇 張玲 徐亞東 鹿愛平

腫瘤嚴重威脅人類健康，其發(fā)病率和死亡率居各類疾病之首且仍逐年上升。現(xiàn)臨床通過采用中西藥結(jié)合的方法治療腫瘤來達到減毒增效的目的。丹參酮ⅡA（tanshinone ⅡA，TanⅡA）藥理作用表現(xiàn)在抗動脈粥樣硬化、縮小心肌梗死面積、降低心肌耗氧量，對血栓形成以及血小板聚集功能有抑制作用[1-3]，且大量體外研究顯示，其對多種腫瘤細胞具有殺傷、抑制增殖、誘導分化及促進凋亡的作用[4-5]。但TanⅡA體內(nèi)的抗癌作用及機制目前報道不多，本實驗以Lewis肺癌荷瘤小鼠為研究對象，觀察TanⅡA在體內(nèi)對肺癌生長的抑制作用及對Bcl-2、Bax蛋白表達的影響，來進一步探討TanⅡA的抗腫瘤機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液（上海第一生化藥業(yè)有限公司（國藥準字H31022558），規(guī)格為10mg/2mL）。環(huán)磷酰胺（CTX江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，每支200mg，批號06052021，國藥準字H32020857）。

表1 丹參酮ⅡA對小鼠體內(nèi)Lewis肺癌生長的影響±s，n=10）

表1 丹參酮ⅡA對小鼠體內(nèi)Lewis肺癌生長的影響±s，n=10）

注：與鹽水陰性對照組比較，*P 0.01；與CTX組比較，▲P 0.05，▲▲P＜0.01

組別 瘤重（g） 抑瘤率（％）NS組 3.338±0.201▲▲ 0 TanⅡA組 2.485±0.188*▲▲ 25.65 TanⅡA＋CTX組 1.205±0.385*▲ 58.26 CTX組 1.178±0.982* 50.14

表2 各組Bcl-2、Bax表達水平比較（x±s）

1.1.2 動物及試劑 C57BL/6純系小鼠，雄性6～8周，（20±2）g，40只，北京維通利華公司動物實驗中心，動物許可證號：SCXK（京）2002-2003。兔抗鼠Bax單克隆抗體、兔抗鼠Bcl-2單克隆抗體（SANTA CRUZ公司）、二步法免疫組化檢測試劑盒，DAB顯示劑（北京中杉金橋公司）。

1.1.3 瘤株Lewis 肺癌，Lewis肺癌荷瘤鼠由中科院腫瘤研究所提供并傳代保種；動物許可證號：SCXK（京）2004-0001，Lewis 肺癌維持在C57BL/6小鼠體內(nèi)，每2周傳代1次。

1.2 方法 將40只雄性C57BL/6純系小鼠隨機分為4組，每組10只，右腋皮下接種肺癌瘤株細胞，建立lewis肺癌小鼠模型，從接種腫瘤次日開始，分別腹腔注射給藥：TanⅡA組：15mg/（kg·d），連續(xù)給藥10d；生理鹽水（NS）組：0.9％生理鹽水0.2mL，連續(xù)10d；環(huán)磷酰胺組（CTX）：25mg/（kg·d），隔日給藥一次，共5次；TanⅡA+CTX組：按TanⅡA 15mg/（kg·d）連續(xù)給藥10d，于接種瘤細胞后24h隔日一次給予CTX 25mg/kg共5次。末次給藥后24h，小鼠稱重，處死。

1.3 觀察指標與測定方法

1.3.1 瘤重 末次給藥后24h將小鼠稱重，斷頸處死，剝?nèi)×鰤K稱重。抑瘤率（％）=（模型組平均瘤重-治療組平均瘤重）/模型組平均瘤重×100％。

1.3.2 丹參酮ⅡA對Lewis肺癌Bcl-2、Bax表達的影響 免疫組化法測定Bcl-2、Bax表達。瘤塊以石蠟包埋制成4μm厚的切片，脫蠟、水化后，3％H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，高壓抗原修復，后續(xù)步驟按照二步法免疫組化檢測試劑盒說明書操作。陰性對照以0.01mol/L PBS（pH=7.4）代替一抗。在光學顯微鏡下觀察鹽水對照組和各給藥實驗組樣本的免疫組化切片。

1.3.3 結(jié)果判定 每張切片在5～10個高倍視野下進行細胞計數(shù)，每個視野計數(shù)100～200個細胞，共1000個細胞，計算每張切片陽性細胞數(shù)所占比例。Bcl-2在胞漿出現(xiàn)棕黃色染色為陽性染色。Bax在胞漿和（或）胞膜出現(xiàn)棕黃色染色為陽性染色。

1.4 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)均以x±s表示，采用SPSS13.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 各組藥物對Lewis肺癌實體瘤的影響

結(jié)果顯示TanⅡA組的瘤重和瘤大小均明顯小于鹽水對照組（P＜0.01），抑制瘤率為25.65％；TanⅡA＋CTX組抑瘤率為58.26％，高于CTX組的抑瘤率50.14％（見表1）。故提示TanⅡA對小鼠體內(nèi)Lewis肺癌生長具有抑制作用，TanⅡA聯(lián)合CTX組的抑瘤率高于單用CTX。

2.2 各組藥物對Lewis肺癌Bcl-2及Bax表達的影響 結(jié)果表明，與鹽水對照組相比，TanⅡA組及TanⅡA+CTX組的Bcl-2表達明顯降低；Bax表達明顯升高，結(jié)果有顯著性差異（見表2）。

3 討論

肺癌的發(fā)生是一個涉及多因素多階段的復雜過程，近年來研究表明，肺癌的發(fā)生可能是由于細胞凋亡與增殖失衡造成的。細胞凋亡是細胞自身的一種主動的、生理性死亡機制，細胞調(diào)亡過程受促調(diào)亡因子和調(diào)亡抑制因子的共同調(diào)節(jié)。其中Bcl-2和Bax屬于Bcl-2同一家族，是Tsujimoto和oltvai發(fā)現(xiàn)的與人類多種腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系的基因。Bcl-2是從人類濾泡型非霍奇金B(yǎng)細胞淋巴瘤克隆到的原癌基因，其通過穩(wěn)定線粒體膜的功能，阻止線粒體釋放Caspase、凋亡誘導因子和細胞色素C等作用抑制細胞凋亡[6]。Bcl-2通過抑制細胞凋亡而參與腫瘤的發(fā)生。Bax基因具有拮抗Bcl-2的作用，是促凋亡基因。當Bax蛋白大量表達，并與Bcl-2蛋白形成異源二聚體時加速細胞死亡，Bcl-2和Bax的表達程度對決定細胞接受凋亡信號后存活與否起關(guān)鍵作用。目前，多數(shù)研究表明，Bcl-2與Bax的表達之間呈負相關(guān)，Bcl-2過量表達，細胞存活；Bax蛋白過量表達，細胞死亡。

本研究結(jié)果顯示TanⅡA對荷瘤小鼠腫瘤的生長有一定的抑制作用，且可顯著提高環(huán)磷酰胺的抑瘤作用。免疫組化結(jié)果顯示，與鹽水組比較，TanⅡA組及TanⅡA＋CTX組的Bcl-2表達明顯降低，Bax表達明顯升高。表明TanⅡA可下調(diào)Bcl-2和上調(diào)Bax表達，提示TanⅡA誘導小鼠Lewis肺癌細胞凋亡的機制可能是通過下調(diào)Bcl-2表達和增強Bax表達而實現(xiàn)的；且與環(huán)磷酰胺聯(lián)用有協(xié)同作用。

[1]張玉芳,趙春景.丹參酮ⅡA及其鈉鹽的藥理研究進展[J].中國藥業(yè),2008,17（1）：1.

[2]石遠,姜同英,王思玲.丹參酮ⅡA及其制劑開發(fā)[J].世界臨床醫(yī)藥,2007,28（7）：439.

[3]Huang X,Zhang YM.Cardiovascular pharmacology of tanshinoneⅡA sulfonate[J].Foreign Medical Sciences[J].Traditional Chinese Med edit,1995,17（1）：9.

[4]梁勇,羊裔明,袁淑蘭.丹參酮藥理作用及臨床應用研究進展[J].中草藥,2000,1（4）：304.

[5]Wu Y,Yang YM,Meng WT.Induced differentiation effect of tanshinoneⅡA on K562 cell lines[J].JWCUMS,2002,33（1）：77.

[6]Fiskum G.Mitochondrial participation in ischemic and raumatic neuronal cell death[J].Neurotrauma,2000,17（7）：843-845.