熱休克蛋白HSP60基因在耐藥白血病中的表達研究

雷博

多藥耐藥（MDR）[1]是白血病化療失敗的主要原因，目前已知的多藥耐藥機制還不能完全解釋白血病的MDR現象，因此發現新的耐藥相關且共表達的基因是揭示白血病MDR機理、改善化療效果和預后的迫切需要。我們實驗室應用改良的消減雜交技術以急性白血病耐藥細胞系（HL60/VCR）和敏感細胞系（HL60）為研究對象建立了急性白血病多藥耐藥相關消減cDNA文庫[2]，篩選出23條表達有差異的基因，經查閱文獻和生物信息學分析，本實驗從中選取熱休克蛋白HSP60基因作為進一步的研究對象，應用熒光定量RT-PCR的方法在臨床病例中進行檢測，以分離和確認新的白血病耐藥相關基因。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

白血病患者39例，選自2008年11月～2009年11月西安交通大學第二附屬醫院血液科住院病人，均在本院血液實驗室經FAB形態學、免疫學、細胞遺傳學的MIC分型確診，符合造血組織腫瘤新WHO分類標準。其中非淋巴細胞白血病23例（化療敏感者17例，耐藥者6例），淋巴細胞白血病13例（化療敏感者7例；耐藥者6例），急性混合細胞白血病1例（為耐藥者），多發性骨髓瘤2例（化療敏感者1例，耐藥者1例）。男性20例，女性19例，中位年齡35歲（5～75歲）。同時以6名健康人為對照組，男4例，女2例，中位年齡28歲。（臨床耐藥診斷標準參閱1997年全國難治性白血病研討會所制定的診斷標準。）

1.2 骨髓和外周血細胞HSP60mRNA表達的實時熒光定量RT-PCR檢測抽取樣本骨髓（臨床患者）或外周血（正常健康人），用淋巴細胞分離液（天津灝洋生物制品公司產品）分離單個核細胞，抽提細胞總RNA，用紫外吸收測定法檢測 RNA濃度和純度，變性瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射光下觀察并拍照。5μg總RNA經逆轉錄合成cDNA（MBI公司產品），逆轉錄反應為70℃5分鐘,42℃1小時、70℃10分鐘，cDNA溶液儲存于-80℃備用。HSP60及內參β-actin的擴增引物見表1，引物由上海生工生物技術有限公司合成。

按照SYBR Premix real time PCR Mix（AmpliQ公司）試劑說明檢測HSP60和內參β-actin的mRNA表達水平，使用 AB I GeneAmp5700 real time PCR儀完成real time PCR反應。PCR反應條件為：94℃預變性5分鐘，然后按94℃30秒，62℃1分鐘，72℃1分鐘，35個循環，最后72℃延伸10分鐘。對每一樣本同時進行3個PCR反應檢測，PCR產物在1.2％瓊脂糖凝膠電泳，GoldViewTM染色，以檢測PCR產物是否為單一特異性擴增條帶。

表1 引物列表

表2 白血病組與正常對照組HSP60基因表達的比較

表3 耐藥與敏感組HSP60基因表達的比較

表4 HSP60基因在AML與ALL中表達的比較

本研究用比較Ct值相對定量法檢測mRNA表達水平，應用公式為：①根據靶基因和內參照基因的標準曲線用公式Y=101 /△Ct（△Ct等于靶基因每稀釋10倍時，平均增加的Ct數）分別計算兩者Ct值每減少1個循環時對應的模板DNA的增加倍數，求出Y值；②靶基因的相對含量，公式為：Y靶Ct靶基因均值-Ct靶基因（Ct靶基因平均值表示所有樣本中靶基因的Ct值的均數，Ct靶基因表示不同個體樣本的靶基因Ct值）；③用同一個體的內參β-actin對其HSP60的mRNA表達水平做標準化處理，代表這1個個體白血病細胞中靶基因的表達水平，公式為：Y靶標準化=Y靶/Yβ-actin。比較標準化后各組HSP60mRNA的相對表達水平。

1.3 統計學方法

熒光定量PCR結果采用SPSS13.0統計軟件分析，原始數據用Excel錄入，用Kruskal-wallis H檢驗，組間比較用Mannwhitney U檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

實時熒光定量RT-PCR結果對所提取總RNA經分光光度計檢測，其A260/A280比值均在1.8..2.1之間，經2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，溴化乙錠染色，28S、18S、5S帶清晰可見，無明顯降解。根據靶基因和內參照基因β-actin的標準曲線用公式Y=101/△Ct，計算β-actin和HSP60的Y值近似相同約為2.15。表示各基因Ct值減少1個循環對應的模板DNA的增加倍數為2.15倍。既然Y值近似相等，那么可以應用簡化公式2.15Ct內參照基因-Ct靶基因來計算每一樣品每一基因的相對含量，最終得到的值即為此樣品此基因的校正后的相對含量。

從表2可以看出HSP60基因在AL和正常組中的表達量有顯著性差異，白血病組mRNA的表達明顯高于正常組；從表3可以看出HSP60基因在耐藥和敏感組中的表達量有統計學意義，耐藥組明顯高于敏感組；從表4可以看出HSP60基因在ALL和AML患者中的表達，沒有明顯差異。

3 討論

在白血病的治療中MDR已成為阻礙其療效的一個重要問題，對各種耐藥機制作用的深入研究必將有利于提高化療療效。既往研究已發現了很多耐藥機制，但以這些分子作為靶點的耐藥逆轉研究目前仍存在許多難以克服的問題，繼續尋找新的耐藥分子靶點仍是當前研究的重點。

熱休克蛋白HSP是普遍存在于生物體細胞中的一組高度保守的蛋白質，平時表達量很低，在理化因素、病原體及細胞惡變等應激狀態下合成量增加。熱休克蛋白的生物學功能廣泛，主要通過在應激狀態下保護細胞生命活動必需的蛋白質以維持細胞生存，增加細胞耐受性和抗凋亡能力。在腫瘤細胞內，熱休克蛋白的大量表達可能由于腫瘤細胞的不斷增殖需要HSP作為分子伴侶來調節和穩定這一增殖過程[3]。一方面HSP可與多種原癌基因相互作用，影響細胞周期，調節細胞增殖；另一方面介導錯配蛋白的降解，協調腫瘤細胞的蛋白質快速代謝平衡，使腫瘤細胞得以無限增殖。此外，HSP在腫瘤細胞的抗凋亡過程中發揮著重要作用[4]。正常細胞中僅表達少量HSP參與細胞生長代謝，并受細胞周期的嚴格調控，而腫瘤細胞即使在無應激條件下，也能獨立于細胞周期持續高表達HSP，在維持細胞的永生性上起作用。HSP作為分子伴侶在正常細胞中發揮抵抗應激的保護作用，在腫瘤細胞中則表現為對化療的耐受性增強，可能與白血病細胞的多藥耐藥有關。HSP70、HSP27[5]已有研究證明與AL耐藥相關，而HSP60[6]作為熱休克蛋白的主要成員其與腫瘤耐藥的研究報道很少。本實驗檢測結果表明：HSP60基因在AL耐藥組、敏感組和正常對照組間有顯著性差異；白血病組高于正常對照組，與研究報道一致；耐藥組高于敏感組，P＜0.05。ALL患者HSP60mRNA的表達水平高于AML患者，但結果不具有統計學意義。

總之，本實驗從cDNA文庫中選取熱休克蛋白HSP60，研究其在臨床病例中的表達情況，在臨床上對AL患者提供化療效果、評判預后和指導個體化治療的實驗室和理論依據，同時篩選出新的MDR相關基因，為發現白血病MDR發生的新機制和逆轉耐藥治療提供新的途徑和靶點。

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