舌鱗狀細胞癌Survivin、VEGF表達的相關性及其臨床意義的研究

孫海媛 王琳 白宇宏

舌鱗狀細胞癌是口腔惡性腫瘤中最常見的腫瘤，一般惡性程度較高，生長快，浸潤性較強，常發生早期頸淋巴結轉移。術后5a生存率仍約為6.6％～11.7％，嚴重影響患者的身心健康，降低了生存質量。細胞癌變源于基因異常表達，細胞處于癌變啟動階段時，細胞形態尚未發生變化，但一些酶類已開始異常表達,Survivin和VEGF基因可能就是其中之一，檢測以上因子，可輔助臨床現行的診斷方法，為探求更加有效的治療手段提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取河北省唐山市多家醫院2000年1月～2007年12月口腔頜面外科手術切除腫瘤標本的石蠟塊45例，所有標本皆經病理診斷為舌鱗狀細胞癌。10例正常舌黏膜，取自舌外傷組織。患者年齡：≥60歲21例，60歲24例。腫瘤組織病理學分級：20例高分化舌鱗狀細胞癌，13例中分化舌鱗狀細胞癌，12例低分化舌鱗狀細胞癌標本。按照2002年國際抗癌聯盟（UICC）公布的口腔癌TNM分期標準進行臨床分期：Ⅰ期10例，Ⅱ期14例，Ⅲ期12例，Ⅳ期9例。在舌鱗癌標本中，伴頸淋巴結轉移18例，無頸淋巴結轉移27例。所有患者皆未接受任何系統的放、化療。

1.2 主要試劑

鼠抗人CD147多克隆抗體、鼠抗人VEGF多克隆抗體、pv9000兩步法免疫組化試劑盒、DAB Kit試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術公司。

1.3 免疫組織化學染色

所有標本經4％甲醛溶液固定，石蠟包埋，常規切片，片厚4m，脫蠟至水。免疫組化染色按照試劑盒說明書進行。舌鱗癌組織陰性對照以PBS代替一抗進行組織化學染色。

1.4 結果判定

所有切片均由兩位有經驗的病理科醫生，雙盲閱片，每張切片在高倍鏡（×400）下觀察5個不同視野內的細胞CD147、VEGF染色情況，以胞漿或包膜淺黃色或棕黃色為陽性細胞，按陽性細胞占百分比及染色程度分級評分。陽性比例：10％～25％為1分，26％～50％為2分，51％～75％為3分，＞76％為4分。染色深淺：無色為0分，淺黃為l分，黃色為2分，棕黃為3分。上述兩項相加，得分＜2分記為陰性，≥2分記為陽性。

1.5 統計學分析

應用SPSS15.0統計學軟件，舌癌病理分級之間CD147和VEGF的表達應用x2檢驗，舌癌中CD147和VEGF的表達關系采用Spearman等級相關檢驗，P＜0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 Survivin、VEGF在舌鱗癌組織與正常舌組織中表達情況的比較Survivin、VEGF蛋白主要位于舌鱗癌細胞的胞漿中，為粗細不一的棕黃顆粒以中強染色為主。正常舌組織中未見Survivin、VEGF的染色，Survivin、VEGF在舌鱗癌組織中陽性表達率分別為66.7％（30/45）、71.1％（32/45），與正常舌組織間有非常顯著的統計學意義（P＜0.01）。

表1 VEGF在舌鱗癌中的表達與各種臨床病理參數的關系

表2 舌鱗組織中Survivin、VEGF的相關性

2.2 Survivin、VEGF在舌鱗癌中的表達與各種臨床病理參數的關系（表1）。

2.3 Survivin、VEGF在舌鱗癌組織的相關關系（表2）

在30例Survivin陽性表達的舌鱗癌中有26例VEGF表達陽性，占86.6％；在15例Survivin陰性表達的舌鱗癌中有6例VEGF表達陽性，占40％。經Spearman相關分析，兩者之間成正相關，相關系數r=0.485（P=0.0019）。

3 討論

腫瘤細胞凋亡是目前分子生物學研究的一個熱點。在生物進化過程細胞生死的程序已經以基因的形式存儲于細胞中，同樣也存在著抑制凋亡的基因，正常情況下這兩類基因處于協調的平衡狀態，以確保細胞生死有序。Survivin是細胞凋亡抑制蛋白家族中的新成員，是迄今為止發現的抑制凋亡作用最強的因子，Survivin不僅抑制細胞凋亡，還參與對細胞分裂的調控，并在血管形成過程中，對維持血管內皮細胞的正常增殖起重要作用[1]。本實驗中Survivin蛋白在正常粘膜不表達，而在舌鱗癌中高表達，與Tanaka等[2]對口腔鱗狀細胞癌的研究是一致的，使Survivin基因成為腫瘤基因治療的一個理想的攻擊靶點。有淋巴結轉移的舌鱗癌組織中，Survivin基因的陽性表達率顯著高于無淋巴結轉移的舌鱗癌組織（P＜0.05），這與Lo Muziol等[3]的研究結果相一致。此研究結果表明，異常表達的Survivin可能通過抑制舌癌細胞自身凋亡的過程，使腫瘤細胞出現無限制生長，Survivin對舌癌的發生、發展起著促進作用，測定舌鱗癌組織中Survivin基因的陽性表達對判斷預后有著指導作用。高、低分化組之間差異有統計學意義（P＜0.05），臨床分期Ⅰ、Ⅱ期和Ⅲ、Ⅳ期之間的表達有顯著差異（P＜0.05），均為臨床診斷、判斷預后提供了重要參考。

癌癥死亡的原因85％～95％均為轉移所致[4]，舌癌遠端轉移的發生率明顯受腫瘤的大小影響，T4較T1-3更易發生遠端轉移[5]。當腫瘤直徑達到或超過1～2mm時，經微循環滲透提供的營養物質已不能滿足腫瘤的生長需要，此時向腫瘤提供營養物質的血管逐步形成。VEGF是目前已知的作用最強、特異性最高的促血管生長因子，VEGF的表達與腫瘤的病程及惡性程度密切相關。最近的研究發現，腫瘤細胞不僅分泌VEGF，同時還能表達VEGF受體，VEGF能直接刺激腫瘤細胞的增殖[6]。因此，在腫瘤的生長和轉移中VEGF扮演了一個重要的角色，可作為腫瘤代謝及轉移的標志。Konno等[7]研究發現，26例大腸癌中VEGF的表達顯著高于癌旁正常組織，而且VEGF的表達與腫瘤的大小顯著相關。李宏捷等[8]研究顯示VEGF的表達與舌癌組織的淋巴結轉移及TNM分期有關，進一步證實了VEGF與腫瘤的侵襲和轉移關系密切。而通過阻斷VEGF抑制腫瘤血管形成，從而抑制了腫瘤的生長也為部分學者證實。

本實驗結果顯示：VEGF在舌鱗癌組織中的高表達率，說明VEGF過度表達與促血管形成有密切關系；舌鱗癌中VEGF在臨床分期Ⅰ、Ⅱ期和Ⅲ、Ⅳ期之間的表達有顯著差異（P＜0.05）；隨著TNM分期的進展，Ⅲ、Ⅳ期舌鱗癌體積增長加快，新生血管無論從數量上還是質量上均不能滿足腫瘤組織生長的需要。腫瘤細胞迅速生長時對氧氣的需要增加，必然導致缺氧，而缺氧可以誘導腫瘤細胞旁分泌VEGF。因此筆者認為Ⅲ、Ⅳ期舌鱗癌VEGF表達的增加，與其癌的體積及浸潤深度的增加使得癌灶內相對缺氧有關。舌鱗癌中VEGF的表達在淋巴結轉移組和無轉移組亦有顯著差異（P＜0.05），腫瘤的血道和淋巴道轉移都與血管和淋巴管的內皮細胞結構及連接方式有關。而VEGF能特異性作用于血管內皮細胞促使其增殖并能增加血管的通透性。Pepper等[9]研究認為淋巴內皮細胞的生長與血管內皮細胞相似，均受VEGF等細胞因子的調控，VEGF同時具有促進淋巴管內皮細胞增生的能力。

細胞的凋亡不但與腫瘤的發生、發展有關，而且與血管的生成、腫瘤的轉移密切相關。Survivin與VEGF在腫瘤細胞的增殖及腫瘤新生血管之間有著密切關系。O’connor[10]應用VEGF誘導靜止期的內皮細胞分裂，結果內皮細胞內的Survivin表達水平上升約16倍，高表達的Survivin抑制了各種指向Caspase的凋亡機制，從而保護內皮細胞逃避凋亡。Mehdi Mesri等[11]利用Survivin的反義核苷酸抑制血管內皮細胞中Survivin的表達后，發現VEGF保護內皮細胞功能減低。本實驗結果發現：Survivin蛋白表達與VEGF蛋白表達呈正相關（r=0.485,P＜0.01），表明Survivin與VEGF在腫瘤的發生、發展中起著協同作用，在免疫組化的研究水平揭示了這兩個腫瘤相關基因之間可能存在著相互調控。Survivin和VEGF表達的上調與舌癌臨床病理特征密切相關，并且存在正協同關系。因此，對二個指標的聯合檢測有利于臨床舌癌的診斷、轉移及預后的判斷，針對二者在舌鱗癌發展及腫瘤血管形成中的相互作用機制而開發抗腫瘤藥物，或靶向Survivin和VEGF基因治療，將提供舌癌治療的新途徑。

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[3]Lo Muzio L,Pannone G,Staibano S,et al.Survivin expression in oral squamous cell carcinoma[J].Br J Cancer,2003,89（12）：2244-2248.

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