實驗動物細菌學監測工作中存在的問題及建議

張麗芳

（中國醫學科學院 北京協和醫學院醫學實驗動物研究所 衛生部實驗動物檢測中心，北京 100021）

實驗動物微生物質量控制標準是評價實驗動物質量的重要指標，隨著生命科學研究對實驗動物質量不斷提出新的更高要求，已有的實驗動物質量標準和檢測體系已不能完全適應其發展的需求，現將我國實驗動物細菌學監測標準中存在的問題及建議分述如下：

1 我國細菌檢測項目不全，難以對動物質量進行準確客觀的評價

與國際上多數實驗動物質量標準相比［1-7］，以下病原微生物未列入我國國家標準檢測項目，這些病原缺乏基礎性研究，未建立相應的檢測方法，檢測項目和檢測能力的不足造成難以對動物質量進行準確客觀的評價。

（1）螺桿菌（Helicobacter spp）：螺桿菌的宿主范圍非常廣泛，包括整個哺乳類動物、禽類、家畜、非人靈長類動物和海洋生物如鯨魚等，引起各種癥狀包括癌癥的疾病［8］。目前從大鼠、小鼠、沙鼠。

等嚙齒類實驗動物中已陸續分離到至少13種嚙齒動物螺桿菌［9］，其中重要的有H.bilis，H.hepaticus，H.rodentium，H.typhlonius，H.trogontum，H.gammani。嚙齒動物螺桿菌能導致小鼠肝炎、肝細胞瘤、盲腸結腸炎、膽管炎、肝膽腫瘤等多種腸肝疾病［10-13］，嚴重影響實驗動物質量。更重要的是，感染螺桿菌的動物用于人類消化道疾病研究，以及藥品、保健食品、化妝品等安全性評價時，其結果將受到干擾。螺桿菌在嚙齒類實驗動物中有較高的感染率，如2001～2005年間，亞洲、歐洲及北美洲不同來源的34個實驗小鼠群中有30個感染螺桿菌，陽性率為88％［9］；我國實驗動物也存在該類螺桿菌感染［14］，對北京市部分清潔級大鼠、小鼠和沙鼠檢測結果表明，螺桿菌帶菌率幾乎為100％［15］。國外已將螺桿菌作為嚙齒類實驗動物必須排除的病原菌列入常規檢測項目，PCR方法和測序是目前螺桿菌檢測的金標準，我國已陸續開展螺桿菌檢測方法的研究［14-16］。

（2）CAR桿菌（Cilia-associated respiratory bacillus，CAR）：CAR桿菌首先分離自實驗大鼠，隨后從實驗小鼠、兔、豬、山羊、牛、羚羊、鹿、狍等多種動物中發現［17-22］，引起大、小鼠慢性呼吸道疾病，多與肺支原體和病毒協同感染，引起細支氣管擴張、化膿性支氣管炎、氣管炎，肺膿腫、肺不張，檢測方法有血清學、PCR、組織病理學。CAR桿菌不能在無活細胞的人工培養基上生長，這種生物學特性給該菌的檢測帶來一定困難，不同來源菌株差異很大，兔株和大鼠株16SrRNA序列同源性僅達48.8％［23］，菌株的差異使分子生物學方法如PCR在我國也無法開展。我國沒有將其列為實驗動物檢測項目，對該菌的研究基本為空白，缺乏病原學、流行病學資料。

（3）牛棒狀桿菌（Corynebacterium bovis，C.bovis）：牛棒狀桿菌是裸鼠角化過度性皮炎、棘皮癥的病原［24］，發病裸鼠背部及兩側出現鱗片樣小白點，此病為一過性，但傳播迅速，幾天內發病率達80％，乳鼠死亡率相當高，Scid成年小鼠也可致病［25］。C.bovis是國外免疫缺陷小鼠必檢項目，檢測方法為分離培養法，國內未見相關的研究報告。

（4）嚙齒檸檬酸桿菌（Citrobacter rodentium，C.rodentium）：美國、日本爆發流行以小鼠降結腸嚴重增厚為病理特征的傳染性鼠結腸增生癥，造成乳鼠中等死亡率，病原分離證實為嚙齒檸檬酸桿菌（曾用名非典型性檸檬酸桿菌，弗氏檸檬酸桿菌4280），是檸檬酸桿菌屬中唯一分離自小鼠的基因種。近年來嚙齒檸檬酸桿菌成為研究的熱點不僅僅是其對實驗動物質量及動物實驗的影響，嚙齒檸檬酸桿菌是目前所知唯一與人類腸出血性大腸桿菌（enterohemorrhagicE.coli，EHEC）和腸致病性大腸桿菌（enteropathogenicE.coli，EPEC）擁有相同Lee毒力島的鼠類自然病原［26-28］。C.rodentium與致病性大腸桿菌在生物學特性上相似，在日本曾經被歸為小鼠的致病性大腸桿菌O115血清型，我國國家標準中列為必要時檢測的項目的大腸桿菌O115 a，C，K（B）（Escherichia coliO115 a，C，K（B））為C.rodentium的一種，國標中推薦的檢測方法僅僅針對于Escherichia coliO115 a，C，K（B），因此對C.rodentium在我國的影響程度尚不得而知。

2 部分檢測方法特異性、敏感性不高，檢測試劑標準化不足

我國國家標準中雖然對各種微生物均提出一種或多種檢測方法，但對具有一定難度的病原微生物檢測技術，僅停留在引用已有的基本方法，滿足常規檢測的水平上，致使將某些可操作性較差的方法寫入國家標準，部分項目檢測試劑的供應和試劑標準化嚴重不足，某些項目的檢測在實際工作中無法實施，或由于方法自身的問題導致檢測結果不準確，使實驗動物微生物質量檢測工作缺乏可信性和可靠性，阻礙了國家標準的實施。以下病原雖然列入國家標準檢測項目，由于檢測方法缺陷使檢測結果可信度不高：

（1）泰澤病原體（Clostridium piliforme）：目前泰澤病原體感染尚無可靠的診斷方法。歐美對該菌常用的檢測方法有血清學（MFI、ELISA、IFA）、分子生物學（PCR）和組織病理學等方法，我國已將IFA作為常規檢測方法應用于泰澤病原體檢測，由于難以純化診斷抗原，ELISA方法還未開展。泰澤病原體是近年來國內外檢出率較高的細菌之一，西歐2000-2003年間實驗大鼠泰澤抗體陽性率高達65％［29-31］。我國清潔級大鼠泰澤抗體陽性率達50％左右，但追蹤抗體連續陽性的動物群均未發現任何臨床癥狀（未發表資料），而且大鼠陽性率顯著高于小鼠。病原學和血清學檢測的相符性，病原確切的體內規律均需深入研究。

（2）支原體（Mycoplasma spp）：支原體為我國國家標準中必須檢測項目，分離培養法和ELISA方法為我國國標推薦的支原體檢測方法，由于缺乏診斷試劑，各檢測實驗室多使用分離培養法，但多年未見檢出報道；國外多采用血清學方法（ELISA、IFA、MFI）進行實驗動物肺支原體（Mycoplasma pulmonis，M.pulmonis）感染的檢測，大小鼠肺支原體陽性的報道近年來屢見不鮮，被認為是實驗動物最常見的污染菌之一。2007-2008年西歐實驗大鼠肺支原體抗體陽性率達3.6％，小鼠抗體陽性率為0.08％［32］。韓國2006-2007年56個研究機構和8個實驗動物生產機構的小鼠，肺支原體抗體陽性率為1.8％［33］，支原體檢測方法的改進已是迫在眉睫的工作。

（3）念珠狀鏈桿菌（Streptobacillus moniliformis，S.moniliformis）：念珠狀鏈桿菌對人、實驗小鼠、非人靈長類等動物有極強的致病性，美國和加拿大等國已將其作為致死性人獸共患病列入了新發感染性疾病的范疇［34］。國外均采用PCR方法作為S.moniliformis常規檢測方法［1-7］，而我國仍采用分離培養法對念珠狀鏈桿菌進行檢測，其培養營養要求高、生長緩慢、生化反應不活潑、高度多形性、染色特性不穩定和極易形成L型等特點，上述生物學特性采用分離培養法極易造成假陰性結果，檢測方法在念珠狀鏈桿菌感染的控制方面顯得尤其重要。

我國細菌學檢測取材部位較單一，如呼吸道病原的檢測部位僅為氣管會厭部，而Taconic除此之外還選取鼻咽沖洗物和抽取中耳內容物，大大提高了檢出率［1］。

3 檢測頻率單一，缺乏靈活性

我國國家標準規定小動物檢測頻率是3個月，而國外檢測頻率是根據病原特性確定的，分別為2～4、4、12、26、52周。國內近年實驗動物常見污染菌為金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、嗜肺巴斯德桿菌、泰澤病原體，根據本地的感染譜、病原特性和檢測方法的敏感性，調整監測計劃，增加易感菌的檢測頻率，既保證動物質量，又可節省經費，使檢測工作在確保實驗動物質量方面起到應有的作用。

4 現有國家標準取樣要求不適用于特殊動物檢測，應建立哨兵動物標準

我國國家標準規定的動物取樣數量和取樣方法是針對相同飼養條件的動物群體而言，并不適用于基因工程動物和飼養于特殊設施內的動物。

近年來，轉基因、基因突變、基因敲除等基因工程動物的數量和種類迅速增多，轉基因動物在各研究機構的流通，其后果是一些多年前消滅的病原微生物如螨和蟯蟲等重新出現，基因工程動物創制過程中所使用細胞及生物制品污染可能使動物群全軍覆滅［35］。如何對轉基因動物進行檢測，在最大程度上保證這類造價高，群體小而可能風險大的動物群體質量，已引起人們的高度重視。加之各種小型的相對獨立的動物飼養設備應用于各研究機構，增加了監測程序尤其是動物取樣數量的復雜性。

上述問題都可通過放置哨兵動物解決，國外對哨兵動物進行了諸多研究［36］，我國在這方面還是空白。FELASA明確規定了哨兵動物年齡、性別、在各種設施中放置的位置等，為我國基因工程動物的檢測提供了借鑒［7］。

5 缺乏新資源的質量標準和監測體系

隨著生命科學研究的迅猛發展，新的實驗動物資源不斷被開發，并逐步應用于生命現象和人類疾病研究。已有的實驗動物質量標準和檢測體系不能完全適應實驗動物新資源開發利用的需求，質量標準滯后和檢測手段不完善已成為制約實驗動物新資源開發、標準化研究與推廣利用的瓶頸，建立和制定新資源的質量標準和檢測體系，是今后一段時期內的研究重點。

6 建議

6.1 完善標準內容，實現標準國際化

為保證我國生命科學領域中動物實驗結果在國際上具有可比性、得以公認，為使我國實驗動物能夠參與國際實驗動物商品流通，可制定地方和企業標準，加入Helicobacter.spp、CAR桿菌、C.bovis、C.rodentium等病原菌的的檢測項目，使我國實驗動物標準與國際接軌。制定哨兵動物標準。

6.2 增加特殊動物的微生物檢測標準

各國微生物監測標準均規定不同等級動物應排除的病原微生物，這并不完全適用于基因工程動物。人工導致的基因突變可能改變動物的免疫應答反應，基因工程動物可出現檢測標準之外的人類了解很少的微生物引起的臨床感染，實驗動物檢測實驗室應能鑒定用于生物醫學研究動物相關的所有微生物，即了解實驗動物攜帶的所有菌群，這對檢測人員的檢測能力提出了更高的要求。

6.3 加強檢測方法標準化研究，提升監測能力

對未列入我國國家標準的病原菌和檢測方法有缺陷的病原菌如Clostridium piliforme、Mycoplasmaspp、S.moniliformis等開展病原學、流行病學和診斷方法的研究，建立切實可行的檢測方法。

根據生物學特性、表型特征鑒定細菌的傳統的分離培養法是實驗動物國家標準中推薦的檢測方法，相對于血清學方法而言，細菌學檢測很難標準化，各個檢測實驗室所用培養基、檢測程序、培養條件及檢測人員經驗和技術的差異導致各實驗室間檢測結果的差異［37］；國外實驗動物檢測機構已采用各種全自動細菌鑒定系統，大大提高了細菌鑒定的準確性，縮短了鑒定時間。過去20年中，細菌分類學發生了巨大變化，16S rDNA代替細菌表型分類法作為《伯杰氏系統細菌學手冊》（Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology）細菌菌種分類的客觀基礎，在各級分類單位中全面應用核酸研究，在表型特征的基礎上，以DNA資料給予決定性的判斷。當表型鑒定為致病菌時，鑒定結果應用16S rDNA測序等分子生物學方法確認，相對表型鑒定方法，16S rDNA測序鑒定細菌更準確和客觀。這并不意味著表型鑒定方法陳舊過時，模棱兩可的的表型和基因結果可能意味著新種的發現。與國外相比，分子生物學技術在國標中應用較少，我國各實驗動物細菌學檢測實驗室應將PCR等分子生物學方法納入監測能力范圍之內，對提升實驗動物細菌學監測能力和檢測技術水平將發揮重要作用。

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