CIK細胞制備方法的研究進展

賀孟來

（湖南長沙醫學院，湖南 長沙 410219）

隨著腫瘤對人類生存健康的威脅日益嚴重，應對腫瘤的治療模式也發生著日新月異的變化，各種腫瘤治療的新藥物、新技術、新方法層出不窮，其中各種腫瘤的免疫細胞治療非?；钴S[1-3]，成為腫瘤生物治療中重要的發展方向。CIK（Cytokine-Induced Killer）是細胞因子誘導的殺傷細胞治療方法的簡稱，是國內外繼淋巴因子激活的殺傷細胞（LAK）、腫瘤浸潤性淋巴細胞（TIL）和CD3McAb激活的殺傷細胞（CD3AK）之后又一個在國內臨床廣泛開展的腫瘤治療方法。1991年，斯坦福大學的Schmidt-Wolf等[4]首次報道了該細胞。具體方法是將患者外周血單核細胞（PBMNC）進行分離后，在體外經γ干擾素、CD3單抗、白細胞介素1和白細胞介素2等細胞因子刺激后獲得的一群異質細胞，具有增殖速度快、殺瘤活性高、非MHC限制、對正常骨髓造血影響輕微等優點[5]。

目前CIK細胞的制備過程基本相同，主要參照美國斯坦福大學骨髓移植中心建立的CIK細胞培養方法[6]。第0天加入一定量IFN-γ，置37℃、5% CO2培養箱中培養24h，第1天加入適當的IL-2、CD3單抗和IL-1繼續培養，每天觀察細胞生長并根據情況進行擴增。本文總結了一些培養過程中存在的差異，以期實驗室工作人員從中選擇、借鑒，取長補短，建立一套優良的CIK細胞制備體系，更好服務于腫瘤細胞治療的健康發展。

1 CIK細胞的來源

目前的實驗研究和臨床應用主要以自體外周血來源的CIK細胞為主要效應細胞，也取得了一些較為明顯的效果[7,8]?，F在CIK細胞的來源主要有外周血、臍帶血和骨髓。

1.1 自體細胞

采集患者自體外周血中的單個核細胞經體外擴增后回輸，優點是可避免由于交叉感染引發的疾病，安全性得到極大提高。

1.2 臍血來源細胞

臍血來源廣泛，輸注臍血來源CIK細胞不易引嚴重移植物排斥反應，臍血中CIK前體細胞含量高，易擴增更多的CIK細胞[9]。王家祥等[10]比較不同來源CIK細胞體外擴增和殺傷活性時發現，臍血CIK細胞體外擴增快，殺傷活性強，對腫瘤細胞的作用優于外周血CIK細胞。

1.3 骨髓來源細胞

黃文榮等[11]研究發現骨髓來源的CIK細胞增殖能力比外周血來源的CIK細胞稍差，這可能與骨髓和外周血中免疫細胞的分化程度及細胞因子調節網絡的不同有關。考慮腫瘤患者放、化療后骨髓的抑制情況，一定程度上限制了骨髓來源CIK細胞的臨床應用。

1.4 異體細胞

目前基礎研究常用的CIK細胞主要來自異體正常供著，來源廣泛，然而在臨床應用中可能會增加意外感染的機會[12]。

2 培養基選擇

目前用于CIK細胞培養的培養基包括完全培養基（含10%AB型人血清RPMI1640）和無血清培養基。多數研究表明，無血清培養基可代替含血清的完全培養基[13,14]。

2.1 完全培養基，因含有人AB型血清，雖經HBV、HCV及HIV的檢測，但因“窗口期”的存在或仍有可能傳播其他疾病，安全性不高，并且存在批次差異、不宜質控，質量不能保證。

2.2 無血清培養基，則可達到生物潔凈要求，成分明確，質量穩定，便于質控，克服了人AB血清的缺點，能減少患者意外感染的機會，對于免疫治療的推廣應用有重要意義。

3 細胞因子差異

南京大學附屬醫院鄒征云等[15]采用從50mL外周血中分離外周血單個核細胞后，分別應用A、B方法進行培養。A法應用γ-IFN、CD3mAb、IL-2和植物血球凝集素（PHA）行常規培養；B法在A法的基礎上于培養的第2天，另外加入終濃度為10ng/mL IL-4，1000U/mL的GM-CSF。培養2周發現，B法可使CIK增殖倍數明顯提高，最高可達840倍。結論是在CIK培養的第2天，增加細胞因子IL-4和GM-CSF可使CIK得率更高，細胞總數＞5×109，從而使得一次性采血50mL制備的CIK足以滿足臨床回輸治療需要。

北京軍區總醫院郭智等[16]治療復發或難治性淋巴瘤患者采用的CIK細胞制備方法加入細胞因子的順序有所不同：培養第1天加入抗人CD3單抗100ng/mL、人重組IL-1α 100U/mL、人重組IFN-γ1000U/mL，第2天加入人重組IL-2 300U/mL，每3天更換培養液并添加人重組IL-2和人重組IFN-γ以維持其濃度，培養12～14d收獲CIK細胞。

4 培養袋法

常規CIK細胞培養是采用大量的培養瓶，工作量大，且容易污染。北京大學第一醫院石永進等[17]采用1000mL大容量培養袋進行自體CIK細胞大容量培養方法。培養容器采用1000mL大容量培養袋，用一次性注射器進行細胞的定量加樣、取樣，換液時將培養袋在大容量離心機中離心1000rpm 10min，再用分漿夾擠出上清，新配好的培養液經輸液管插入培養袋進液管后輸入培養袋，密封后放入37℃恒溫培養。結果表明大容量培養法使自體CIK細胞擴增總量達1.6×1010以上，回輸CIK細胞使患者PBMNC的殺傷活性明顯增加，未出現不良反應。此方法僅使用3～5個1000mL培養袋即可完成常規方法同樣的工作量，操作更簡便，全封閉的培養操作方式使污染概率大大降低，回輸更安全。

CIK細胞過繼免疫療法作為一種新的治療手段，實驗室與臨床統一的操作規程和標準尚未制定，需要探討的問題還有很多。以上方法值得我們借鑒和完善，今后我們將致力于如何用最經濟的方法獲得足量高效的免疫活性細胞，以便在臨床上更推廣應用。

[1]Hoffman DM,Gitlitz BJ,Belldegrun A,et al.Adoptive cellular therapy[J].Seminars in Oncology,2000,27(2): 221- 233.

[2]Sa YL,Hua YK,Yan XM,et al.The preliminary clinical application of Adoptive immunotherapy with auto- cytokine induced killer cells in the patients with malignant solid tumor[J].The Pratical Journal of Cancer,2006,21(1):11-14.

[3]Y Sun,J Chen,P Cai,et al.Therapy of relapsed or refractory non-Hodgkin's lymphoma by antigen specific dendric cells-activated lymphocytes[J].Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi,2010,18(1):219-23.

[4]Schmidt-Wolf IG,Negrin RS,Kiem HP,et al.Use of a SCID mouse/human lymphoma model to evaluate cytokine induced killercells with potent antitumor cell activity[J].J Exp Med,1991,174(1):139-149.

[5]Schmidt-Wolf IG,Grimm B,Brandt K,et al.Propagation of large numbe0rs of cells of a human mixed-lineage T-lymphoid/myeloid[J].British Journal of Haematology,1995,90(3):512-517.

[6]Lu PH,Negrin RS.A novel population of expanded human CD3 CD56 cells derived from T cells with potent in vivo antitumoractivity in mice with severe combined immunodeficiency[J].J Immunol,1994,153(4):1687-1696.

[7]Leemhuis T,Wells S,Schefold C,et a1.A phase I trial of autologous cytokine-induced killer cells for the treatment of reapsed Hodgkin disease and non-Hodgkin lymphoma[J].Biol Blood Marrow Transp lant,2005,11(3):181-187.

[8]Cai LL,Yang B,Lu XC,et al.Application of immune function test to evaluate effect of cytokine-induced autologous killer cell infusion for ederly patients with hematological malignancies. [J].Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi,2010,18(5):1250-1255.

[9]李鵬鑫,李貴新.細胞因子誘導的殺傷細胞制備的研究進展[J].醫學綜述,2009,15(20):3071-3073.

[10]王家祥,鄭樹,劉秋亮.不同來源CIK細胞的體外擴增和殺傷活性的比較[J].第四軍醫大學學報,2005,26(7):616-618.

[11]黃文榮,張伯龍,靳海杰,等.細胞因子聯合激活人骨髓和外周血免疫細胞的比較研究[J].中國實驗血液學雜志,2002,10(3):222-225.

[12]Sangiolo D,Martinuzzi E,TodorovicM,et al.Alloreactivity and anti-tumor activity segregate within two distinct subsets of cytokine-induced killer(CIK) cells: implications for their infusion acrossmajor HLA barriers[J].Int Immunol,2008,20(7):841-848.

[13]Kambe N,Kambe M,Chang HW,et al.An improved proved procedure for the development of human mast cells from dispersed fetal liver cells in serum-free cuture medium[J].J Immunol Methods,2000,240(1-2):101-110.

[14]蔣永新,李高峰,王熙才,等.無血清培養基與完全培養基體外誘導擴增CIK細胞分泌細胞因子水平的比較[J].腫瘤防治研究,2006,33(11):784-787.

[15]鄒征云,劉寶瑞,錢曉萍,等.從50mL外周血中高效擴增CIK方法的探討[J].腫瘤防治雜志,2005,12(7):515-518.

[16]郭智,陳豐,譚曉華,等.細胞因子誘導的殺傷細胞體外培養技術的評價[J].神經損傷與功能重建,2009,4(2):110-113.

[17]Shi Y,Yu J,Cen X,et al.Large-capacity expanded cytoline-induced killer cells and its cytotoxic activity[J].Sheng Wu Yi Xue Za Zhi,2001,18(1):94-96.