郭霍原則與16S rRNA基因序列分析在確定病原微生物中的應用

19世紀郭霍提出了關于某種微生物是否是病原的理論,這一理論后來被稱為郭霍原則。郭霍原則包括以下3點[1-2]：1.某種微生物在某種疾病的所有病人中存在,包括那些有疑問的以及發生病理改變的病人。2.在其他疾病的病人中不能發現這種微生物。3.從病人中分離的微生物可以純培養,并能引起同樣的疾病。如果滿足這3個條件,郭霍認為：“在某種疾病中出現的微生物不是偶然的,而是這種疾病的病原。”

郭霍原則源于他對結核分枝桿菌和炭疽芽孢桿菌的研究工作,其目的在于建立微生物與疾病之間關系的準則。通過這一準則可以為某種微生物是否致病提供依據,同時也可以促使微生物學家使用更加嚴格的標準來確定病原微生物。這一嚴格的標準構建了微生物和疾病之間關系的框架,對于某些疾病,如結核病,這一原則得到了很好的應用：郭霍在病人組織中觀察到結核分枝桿菌;在體外獲得純培養;并在動物中復制出結核病的模型,而正常的動物和人的組織中沒有發現結核分枝桿菌。但是即使是郭霍自己也很快認識到這一原則的局限性。郭霍認為霍亂和麻風是由某種特定的微生物引起的,但是他并不能完成郭霍原則的所有步驟。盡管霍亂弧菌可以從霍亂病人中分離到,但是在健康人中也可分離到霍亂弧菌;而麻風分枝桿菌并不能獲得純培養。從19世紀開始,人們認識到有很多新的病原-主要是病毒-不能獲得純培養,必須依靠其他的細胞才能復制;伴隨著免疫學以及圖像技術的發展,細菌性、真菌性以及蛋白類病原的病原譜也在不斷的擴大。隨著人類對病原微生物認識的深入,人們逐漸發現了郭霍原則的很多局限和問題,主要體現在以下幾個方面：1.很多病原不能獲得純培養：許多明確的病原微生物如惡性瘧原蟲以及絕大多數病毒只有借助別的細胞才能培養。2.沒有合適的動物模型來復制疾病：一些病原微生物如：HIV病毒,具有宿主局限性,不能在其他動物里面復制出典型的動物模型,因此從實驗和倫理的角度都不可能完成郭霍原則的第三點。3.正常帶菌者：腦膜炎奈瑟菌對某些個體能引起疾病,而對于其他個體來說僅僅是攜帶而無癥狀。4.病原微生物通過毒素致病,從病人身上分離不到病原菌或者是在病原消失后,通過刺激機體的免疫系統引起疾病：如葡萄球菌腸毒素引起的疾病和鏈球菌引起的超敏反應性疾病。5.通過共感染引起疾病或者是一種病毒依靠另外一種病毒才能致病：無毒的白喉棒狀桿菌本身無外毒素基因,只有通過整合噬菌體上的外毒素基因才能致病。6.某種微生物只是引起機體免疫狀態、生理狀態或者基因的變異,而不直接導致疾病,等等。雖然存在著種種局限,但是郭霍原則的意義并不在于其過于嚴格應用,而是其衍生出的嚴格精神。對于病原的研究在于科學的證據,而郭霍原則是收集證據的綱領。

現在的知識告訴我們,感染是微生物在宿主體內的生活中與宿主相互作用并導致不同程度的病理變化的過程,是微生物與宿主在個體、細胞核分子多層面相互作用的生理學現象。即使定義為病原的微生物通常引起的也只是亞臨床感染。比如大部分人接觸到結核分枝桿菌之后并沒有明顯的癥狀,可能僅僅是某些實驗,如結核菌素試驗,為陽性。

郭霍時代之后生物醫學上最具革命性的進步就是發現核酸是生命的基礎。通過檢測及操作核酸分子我們能夠發現及鑒定未知的病原微生物,同時研究病原與宿主的相互關系。相對于病毒因其基因序列之間的巨大差異而找不到可以通用的基因標簽,細菌中很多的基因標簽都可以用于細菌鑒定。這些基因標簽包括編碼5S,16S以及23S rRNA的基因,以及這些基因的間隔區域[3-5],還有其他一些保守基因如編碼延長因子G和質子轉運ATP酶類的序列[6]等。在這些基因標簽中16s rRNA基因由于其自身的優勢成為應用最為廣泛的微生物鑒定基因。首先16S rRNA基因全長約1 550 bp,包括多個保守和可變區域;有足夠的種間多樣性和有效的統計學意義,可以在保守區域設計引物擴增中間片段或者是全長,然后通過比對可變區域進行細菌鑒定和種系分析[7]。其次16S rRNA基因不僅可以對所有細菌進行種系研究,也可以與古細菌的16S rRNA基因以及真核生物的18S rRNA基因進行比較[8]。另外應用于16S rRNA基因序列比對的數據庫有其優勢。目前有多個數據庫可以用來進行16S rRNA基因序列比對,包括公共數據庫(GenBank),商業化數據庫(MicroSeq)以及 SmartGene數據庫等。最常用的是GenBank數據庫,該數據庫中有超過180萬條16S rRNA基因序列(2010年3月的數據,這個數目還在不斷的快速增長)。通過這些數據庫人們可以有效的從數據庫中比對出未知菌屬的菌株[9]。同時數據庫的發展與16S rRNA基因進行細菌鑒定的應用是相互促進的,隨著數據庫越來越大,16S rRNA基因序列也變的越來越吸引人。

應用16S rRNA基因鑒定新的細菌性病原已經有了多個成功的例子。

1 惠普爾病(Whipple's Disease)

1907年有了首例惠普爾病患者的報告,其臨床癥狀為反復發作的關節炎及體重下降、咳嗽、發熱、腹瀉、低血壓、腹部腫脹、皮膚色素沉著及重度貧血。尸檢發現多漿膜炎、主動脈瓣病損及腸粘膜和腸系膜淋巴結脂肪沉積和泡沫狀巨噬細胞的浸潤[10]。

從報告這一疾病開始,就有證據證明惠普爾病是一種細菌性疾病[11-13]。一是通過電子顯微鏡可以從病人的感染組織中觀察到一種桿菌。二是這種疾病抗生素治療有效,且隨著病情的好轉該種微生物會在感染組織中消失;而如果病情復發的話,又會在感染組織中重新發現這種微生物。有兩個不同實驗室對可能的病原進行了研究[14-15]。在第一組的研究中,人們從病損組織中使用通用引物擴增了部分16S rRNA基因序列。通過分析得到的數據,研究者認為在這部分組織中有107個該種微生物,這一數值遠遠高于正常的上消化道組織中應有的細菌數。然而這一發現的特異性沒有通過其他部位的陰性對照來證實。在這個研究中,顯微鏡觀察到的結果和通過核酸擴增技術得到的結果實現了統一,人們認為發現的就是病原[15]。在第二組的研究中,人們得到了相似但是更加完整的16S rRNA基因序列,并且在10份陰性對照中沒有擴增出對應16S rRNA基因序列。研究者使用了幾對相互獨立的通用引物進行16S rRNA基因的擴增,都得到了一致的特異性結果。根據其序列得到的種系發生樹,以及該種疾病和病原特殊的臨床及組織學特征,命名了一個新的種Tropheryma whippelii[14]。在這個研究中盡管病例數有限,但是數據滿足了郭霍原則的頭兩條。而這一結果在以后對惠普爾病的研究中得到了證實[16-17]。

2 人埃立克體病(Human Ehrlichiosis)

在1986年,Maeda等報道一例51歲男子的病例,其臨床表現為發熱,頭痛,抑郁和肌肉痛,同時伴有輕微的肝炎,急性腎衰,貧血和血小板減少[18]。最初這個病人被診斷為落磯山斑點熱,氯霉素和強力霉素治療有效。醫生們發現病人的血清除了對犬埃里克體的抗體凝集外,對其他血清都不凝集;通過電子顯微鏡觀察發現病人也有巨噬細胞包涵體,這與犬埃里克體病相似。這些結果證明,引起這種疾病的病因可能是犬埃里克體或者是與之相近的種屬。從1987年到1993年,美國共有299例人埃里克體病的報道,其共同的特征是白細胞和血小板減少以及轉氨酶的升高[19]。后來從一個病人的巨噬細胞中培養出類埃里克體的微生物[20]。使用通用引物對培養物以及兩個病人的血標本進行了16S rRNA基因的擴增,通過對序列的分析發現人埃里克體病的病原是埃里克體屬的一個新種,后被命名為查菲埃立克體(E.chaf f eensis),其與犬埃里克體親緣關系很近。后來的研究也證明,犬埃里克體與查菲埃立克體的血清交叉凝集。在19例查菲埃立克體血清陽性的標本中使用特異性引物檢出了查菲埃立克體的16S rRNA基因序列[21]。而第二個埃里克體的新種的發現也應用了16S rRNA基因序列分析方法。90年代初期,美國在多例急性發熱病人的中性粒細胞胞質內發現埃立克體樣包涵體。1995年,Goodman等從病人的血標本分離到該種嗜粒細胞病原體,并使用16S rRNA基因序列對其進行了種屬研究,將它正式命名為人粒細胞埃立克體,其所致疾病稱為人粒細胞埃立克體病[22]。后經16S rRNA基因序列的系統發生分析,發現該種嗜粒細胞病原體與無形體屬種屬關系最近,因此,將其歸于無形體屬的一個新種,命名為嗜吞噬細胞無形體,其所致疾病也改稱為人粒細胞無形體病。

3 桿菌性血管瘤-桿菌性紫癜(bacillary angiomatosis-bacillary peliosis,BAP)

桿菌性上皮樣血管瘤病亦稱桿菌性血管瘤病或上皮樣血管瘤病。1983年由 Stoler等首先報道[23],他們從一個艾滋病病人身上發現一種不同于Kaposi肉瘤的多發性皮膚血管增生性疾病,并在皮損中發現有小桿菌存在;他們認為這是一種新的可以引起皮膚和內臟小血管增生的感染性疾病。后來經研究證實桿菌性血管瘤病可以導致AIDS患者及免疫缺陷病人皮膚小血管的增生以及內臟器官的損傷,同時可以導致貓爪熱。在病損組織中通過War-thin-Starry染色可以觀察到小桿菌。研究者使用通用引物對病人組織提取的核酸直接進行16S rRNA基因的擴增,其中三個相互獨立的病人的基因序列是完全一致的,第四個病人的序列也僅有很小的差別,而在正常組織中沒有擴展出該片段。將這些序列與已知序列進行比較發現這是種病原屬于新的病原,其種系發生關系上與立克次體最接近[24]。這一結果給該病原的培養提供了依據,而后來的培養結果證實這一病原為漢塞巴爾通體(Bartonella henselae)[25-26]。盡管還沒有合適的動物模型,但是病原的培養促進了抗血清和免疫學診斷的發展,最終實現了該種疾病的診斷。

雖然應用16S rRNA基因方法鑒定新的微生物病原已經有了很多成功的應用,但是在實際工作中我們仍然要注意很多的問題。一是在使用16S rRNA基因方法鑒定新病原的時候首先必須確定該疾病是細菌性疾病,這需要染色、顯微鏡技術以及免疫學技術的應用;抗生素的療效可能也會起提示作用。二是需要判斷得到的序列與疾病的關系。疾病通常是一個復雜而長期的過程,在疾病的某個時期從病人某個病損部位中得到的序列信息或者是并沒有擴增出有意義的序列,可能并不能真實的反映微生物和疾病的關系。人們通過16S rRNA基因分析可以獲得某種微生物的信息,但是16S rRNA基因并不是編碼毒力基因的序列,所以得到這個序列并不意味著這種微生物一定致病。另外僅僅得到的序列信息而沒有純化的微生物,就不可能實現郭霍原則的第三點,也就不能嚴格的建立該種微生物和疾病的關系。三是使用通用引物對臨床標本特別是不能嚴格無菌的標本進行擴增的時候通常得到的是一組16S rRNA基因信息;而引起疾病的通常只是其中的某個克隆。如何在這一組數據中挑選出有意義的克隆?有研究稱從以前認為是嚴格無菌的部位擴增出16S rRNA基因,雖然這些結果需要進一步的確認,但是這也給16S rRNA基因方法的使用提出了挑戰[27-28]。而對于那些本來就不能嚴格無菌的標本即使有平行對照其結果的解釋也需要更加慎重。

16S rRNA基因鑒定病原的實驗方法本身也有其缺陷。其中最主要的問題在于PCR方法的高敏感性所帶來的污染問題。即使采取了最嚴格的技術手段去防止污染,使用針對保守基因設計的引物仍然可以在大多數臨床標本中擴增出序列,這是因為無法避免的臨床標本以及PCR試劑中的污染,這種污染甚至包括了Tag酶[29-30]。而在使用16S rRNA基因的通用引物對臨床標本進行擴增的時候,這種污染的情況更容易出現。在我們的實驗中也發現在使用某些Tag酶產品的時候會出現假陽性的結果,這可能是由于Tag酶的生產過程中純化不完全造成的。另外一個值得注意的問題是應用于16S rRNA基因序列比對的數據庫。作為最常用的公共數據庫GenBank,其中雖然有大量的16S rRNA基因序列,但是這些序列并沒有經過篩選。Wilck等人[31]認為雖然GenBank數據庫內容廣泛,其包括了人源,動物源和環境中的致病以及非致病菌的信息,但是其序列并沒有經過有效的評價,其質量不高。他們認為臨床實驗室在使用16S rRNA基因在進行菌種鑒定的時候一定要對數據庫中的相應序列進行評價,這樣才能保證結果的準確。

綜上所述,郭霍原則雖然為病原鑒定方法奠定了堅實的基礎,但是隨著人們對疾病認識的深入,郭霍原則的缺陷也突顯出來。隨著核酸技術的發展,基于核酸序列的病原鑒定方法給人們提供了更多的幫助。相對于傳統的病原鑒定方法基于序列的病原鑒定方法在鑒定非培養的微生物或難培養微生物上有很大的優勢,同時序列信息更加客觀和精確。在某些情況下,序列信息雖然不能確定病原,但是可以給疾病的診斷和治療提供幫助,為了解病原特性和病原分離提供線索。但是在使用基于序列的病原鑒定方法的時候也應該注意到方法自身的問題和局限,同時由于疾病本身的復雜性和長期性,對于序列的結果的解釋也要慎重。

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