甲型H1N1流感血清流行病學研究進展

鄭奎城,沈曉娜,楊式芹,林元波,周朝暉,謝劍鋒,陳 煒,翁育偉,嚴延生

2.福建醫科大學,福州 350004;

3.福建省實驗動物質量檢測中心重點實驗室,福州350001

甲型H1N1流感(甲流)病毒是4源重配病毒,由經典豬流感病毒、歐洲豬流感病毒、禽流感病毒和人流感病毒重配而成,人群對甲流病毒普遍易感。2009年6月11日,世界衛生組織(WHO)宣布將甲流流行警告級別提升為6級,全球進入流感大流行階段。2010年8月10日,WHO宣布進入甲流大流行后時期 。根據WHO公布的數據,在這段時間甲流疫情波及的國家和地區達到214個,死亡病例超過18 449人[1]。根據以往大流行的經驗,WHO預計甲流病毒還會以季節性流感病毒的表現方式出現,并在今后若干年內繼續傳播,病毒很有可能繼續使年輕人群發生嚴重疾病。各國須繼續對此保持警惕。因此,很有必要依據疾病監測報告或血清學監測估計和預測甲流在世界各地的流行強度。雖然甲流在全球廣泛流行,但由于大量輕癥患者和隱性感染的存在,疾病監測系統報告的確診病例不能反映疫情實際情況,而血清流行病學調查方法更適合于調查不同時間節點、不同地區、不同年齡段人群的感染水平及動態變化趨勢。根據文獻報道,對于確定甲流的感染率,血清學監測的敏感度是臨床病例監測的10倍以上[2]。目前甲流血清學研究以血凝抑制試驗(HI)、微量中和試驗(NT)為主,兩者都可以用來估計甲流流行后人群的感染率,但均有優劣點,以下對其研究進展作一略述。

1 血凝抑制試驗方法(HI)

流感病毒能夠與豚鼠、雞紅細胞或人O型紅細胞發生凝集,即為紅細胞凝集現象。這種紅細胞凝集現象可被特異性免疫血清所抑制,即紅細胞凝集抑制現象。其原理是相應的抗體與病毒結合后,阻抑了病毒表面的血凝素與紅細胞表面受體的結合。血凝抑制試驗(HI)是目前最常用的鑒定流感病毒及流感病毒型別的方法。HI長期以來被用作流感病毒感染,疫苗評價,疫苗株篩選的血清學檢驗方法。該方法簡單、易行、結果可靠。

1.1 紅細胞種類對HI敏感性的影響 HI的敏感性受到所使用的紅細胞種類的影響。Stephsen指出在檢測H5N1高致病性禽流感HI抗體時馬紅細胞比火雞紅細胞更敏感[3]。在Lerdsmran的研究中,為了確定以鵝紅細胞和火雞紅細胞為凝集細胞的HI試驗是否得到可比的HI抗體滴度,6名科學家以HI抗體幾何平均滴度為1∶183的人血清為參照,以鵝紅細胞和火雞紅細胞進行平行實驗。結果表明無論是鵝紅細胞或火雞紅細胞,6人得出的HI抗體滴度都為1∶160[4]。進一步對53名甲流患者的急性期和恢復期的雙份血清及100名健康醫務人員的單份血清進行平行實驗,結果表明以鵝紅細胞和以火雞紅細胞的HI試驗,兩者HI抗體滴度的相關系數達0.96(Spearman's rank,P＜0.01)。HI抗體滴度≥1∶40的人數、恢復期與急性期抗體滴度比、抗體滴度呈4倍以上增長的人數都相似,而且結果還顯示鵝紅細胞的血凝樣式比火雞的更清晰。基于鵝紅細胞和火雞紅細胞的HI抗體滴度有可比性,而且在東亞和東南亞地區鵝比火雞更易獲得,所以開展HI試驗時,可用鵝紅細胞代替火雞紅細胞。

1.2 HI抗體陽性臨界值 許多研究者以HI抗體≥1∶40作為判斷甲流感染的臨界值(cut-off value),并以此估計人群的感染率[2,5]。這個臨界值的設定是根據WHO指南,即當流感HI抗體≥1∶40時,人群中50%的人具有保護性抗體水平[6]。然而,Lerdsmran指出,7.5%的甲流患者恢復期血清HI抗體＜1∶40[4]。與此類似,Chen報道在甲流患者發病后的第25至29 d之間,7%的患者其HI抗體＜1∶40[5]。Miller等指出,在55名甲流確診患者中有6名(10.9%)HI抗體滴度低于1∶32[2]。這些結果提示若以HI抗體滴度≥1∶40衡量甲流的感染情況,可能會低估實際的感染水平。進一步分析顯示,成人和低齡兒童HI抗體產生水平并不一致,應以不同的HI抗體陽性臨界值來判斷是否感染甲流。故在 Lerdsmran的研究中,以HI抗體≥1∶20作為低齡兒童的陽性臨界值,而以HI抗體≥1∶40作為成人的陽性臨界值[4]。

1.3 HI抗體與交叉反應 甲流流行前人群是否具有一定的交叉反應抗體,以及季節性流感疫苗對甲流病毒是否有交叉保護作用是倍受爭議的問題。在Lerdsmran的研究中,對71名已接種了季節性流感疫苗對象的血清進行甲流病毒HI試驗,發現有8名(11.3%)HI抗體滴度在 1∶10至≥1∶40之間,其中有1(1.4%)名 HI抗體滴度為1∶80[4]。同樣,Hancock指出在2007-2009年期間注射三價滅活季節性流感疫苗的成人中,有7%的人其甲流HI抗體呈現4倍或以上增長。然而,Kelly則指出,季節性流感疫苗對甲流無保護作用[7],但亦有其他研究者報道季節性流感疫苗對甲流有部分保護作用[8]。

有學者報道,由于既往的季節性流感暴露或疫苗接種,老年人甲流抗體呈較高水平,美國疾控中心也發現甲流流行前≥60歲年齡組HI抗體陽性率在各年齡組中水平最高[9]。Hancock在報告中指出,在1980年后出生的107名對象中有4人(3.7%)其甲流HI抗體≥1∶40,而1950年前出生的115人中有39人(34%)甲流HI抗體≥1∶80。我國江蘇省曾檢測在2008年11月甲流流行前采集的632份血清,發現有3.64%能檢出甲流HI保護性抗體(≥1∶40)[10]。而我們先前的報告指出,在2008年人群甲流HI抗體≥1∶10和≥1∶40的陽性率分別為6.5%和0.63%[11]。這些結果顯示,自然人群在甲流流行前存在著一定的交叉反應抗體,可能與感染豬流感病毒或其它具有抗原交叉性的H1N1亞型流感病毒有關。但迄今為止,國內監測尚未發現類似國外報道的高年齡組人群在甲流流行前具有較高HI抗體陽性率現象,這可能與甲流流行前我國流感疫苗接種率顯著低于國外有關。

1.4 HI抗體的消長 甲流患者或甲流疫苗接種者的HI抗體消長的相關研究還不多,但Wang在其近期的報告中指出,甲流患者在發病后的第15 d,HI抗體≥1∶40的比例從發病前的0%上升到60%,第30 d達到 100%,但在第 180 d下降為52%;而接種單價裂解甲流疫苗的人群HI抗體≥1∶40的比例則為：在接種后的第15 d從接種前的0%上升為78%,第30 d達到81%,第180 d則降為34%[12]。甲流患者在發病后的第15 d和第30 d,其HI抗體的幾何平均滴度(GMT)無顯著變化,但在第180 d GMT則從第30 d的1∶80下降為1∶52。然而,接種疫苗的對象,其GMT在第15 d為1∶100,在第30 d上升為1∶193,但在第180 d則下降為1∶74。這些結果顯示,與甲流患者相比,疫苗接種者的HI抗體陽轉率低,但GMT卻顯著高而且持續時間相對較長。無論是經自然感染還是通過接種疫苗獲得保護性抗體,在6個月之后約一半的調查對象喪失了抵抗甲流再次感染的免疫力。

1.5 HI抗體調查的影響因素 以血清學方法估計人群的甲流感染率受到幾個混雜因子的影響,如由于接種季節性流感疫苗引起的交叉反應,或由于人體內存在1957年流感病毒的抗體等。此外,年齡是甲流HI抗體陽性率的獨立相關因素。我們先前的報告也指出,在甲流流行后的各年齡組之間,無論是HI抗體≥1∶40的率還是 GMT值,均以6～17歲為最高,18～55歲次之,再次為≥56歲,而0～5歲為最低,而且各年齡組之間的差異都有統計學意義,表明年齡是影響甲流HI抗體水平的因素之一[11]。這與甲流病例的分布主要以年輕人群為主相吻合。但不同性別之間抗體陽性率差異無統計學意義,表明不同性別人群甲流的易感性和感染風險類似[10,13]。

2 中和抗體試驗

病毒中和抗體試驗(NT)是敏感而特異的血清學方法,可直接評價血清對病毒的中和保護能力,是檢測抗體與病毒作用的經典方法。其基本原理為血清中的特異抗體與病毒的表面抗原相結合,使病毒失去感染宿主細胞的能力,從而抑制細胞病變的產生。由于中和抗體在血清中維持時間長,不能僅憑中和試驗為陽性結果,作為判斷是否有相應病毒感染的依據。

2.1 血清前處理對NT試驗的影響 在開展甲流的血清流行病學研究時,許多實驗室以NT試驗作為HI試驗的附加試驗。在HI試驗中,通常以霍亂菌液(RDE)對血清進行前處理以去除血清的非特異抑制因子,但在常規NT試驗中,一般未對血清以RDE進行前處理[2]。Lerdsmran的結果顯示,對于無甲流HI抗體的血清,如未采取RDE處理,其NT抗體的GMT異常高,但在以RDE處理后,NT抗體的GM T與HI抗體的GM T具有可比性[4]。提示血清中的非特異抑制因子不僅能使HI試驗產生假陽性結果,也能使NT試驗出現假陽性結果。因此,建議在以NT試驗檢測甲流抗體時,增加 RDE前處理步驟。

2.2 NT抗體與HI抗體的可比性 Lerdsmran對甲流患者發病后54 d內,每隔5 d檢測一次血清HI抗體和 NT抗體,兩種抗體的相關系數為 0.85(Spearman's rank,P＜0.0001)。HI抗體和NT抗體都呈4倍增長最早出現在甲流發病后的第11d。在低年齡組患者中,HI≥1∶20為 100%,≥1∶40為86.1%,而NT 抗體≥1∶20為97.2%,≥1∶40為94.4%。在 44名成人患者中有 43名(97.7%)恢復期血清 HI≥1∶40,而 100%患者的NT抗體均≥1∶80。Grund等采集43名健康對象在接種甲流疫苗前與接種后第21 d的雙份血清,以NT試驗與HI試驗檢測其抗體水平。結果顯示,第二份血清NT抗體和HI抗體呈4倍增長的比例均為95.3%,而且兩種抗體的GMT及其增長幅度都呈很好的可比性[13]。這些結果表明,NT試驗在評價甲流感染后或疫苗接種后抗體的水平變化與HI試驗有良好的可比性。

2.3 NT抗體與交叉反應 Hancock指出,在接種季節性流感疫苗的成人中有7%的人其甲流HI抗體呈現4倍或以上增長,而甲流NT抗體陽性率(≥1∶40)則高達22%[9]。Lerdsmran[4]也指出,在已接種了季節性流感疫苗的對象中,有11.3%的人其HI抗體在1∶10至≥1∶40之間,有1.4%的人高于1∶80,而NT抗體≥1∶40的比例則高達22.5%。Mark等在香港開展的血清學調查中發現,在≥65歲以上年齡組人群中,有37%的人在甲流大流行前其NT抗體≥1∶40[14]。說明與HI抗體相比,甲流NT抗體與季節性流感的交叉反應更廣。

由于HI抗體僅與流感病毒的血凝素受體結合,而NT抗體可與更廣范圍的病毒受體結合,所以相對于 HI抗體而言,NT抗體反應更廣、更敏感[15-16],正由于這個特點,甲流NT抗體與季節性流感病毒或疫苗的交叉反應顯得更高,特別是在50歲以上的接種疫苗者中,其血清NT抗體顯示出高度交叉反應[4,9,13]。此外,NT抗體在血清中維持時間長,因此,若以NT抗體≥1∶40作為判斷甲流感染的臨界值,并以此估計人群的感染率,可能會導致感染率的高估。所以,甲流NT抗體陽性臨界值的設定,還須進一步研究,以準確評估甲流的感染率。

3 展 望

目前甲流病毒以季節性流感病毒的表現方式出現,在某些地區形成一定規模的流行,依然威脅人們的健康。血清流行病學研究可以準確監測和預測甲流在不同時間節點、不同地區、不同年齡組人群的感染水平及動態變化趨勢。除了HI和 NT試驗以外,酶免疫實驗法(EIA)和以ELISA為基礎的微量NT試驗也逐步得以應用,這些方法更便捷快速,但其敏感度和特異度仍有待進一步探討。

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