新城疫病毒誘導產生的抗腫瘤作用相關細胞因子

王 靜,盧志紅,董尚林,劉開揚

新城疫病毒(Newcastle diease virus,NDV)屬禽類副黏病毒科副黏病毒亞科腮腺炎病毒屬,NDV的基因組為單股負鏈RNA,大小約為15～16 kb,包括6種基因,分別用于編碼6種病毒的結構蛋白。NDV按其毒力大小可分為強毒株、中等毒力毒株和弱毒株,NDV強毒株是禽類高度感染的致死性病毒,偶爾感染人類,表現為輕微的流感樣癥狀或結膜炎,一般無需治療,一周左右可自愈。NDV弱毒株能選擇性殺傷人和動物的多種腫瘤細胞[1],具有潛在的治療多種腫瘤的作用,對人無致病力,因此,被廣泛應用于各種抗腫瘤研究中。研究證明NDV的抗腫瘤機制有以下幾個方面:誘導細胞因子的產生;對免疫細胞的調節作用;其 HN蛋白的抗腫瘤作用以及對腫瘤細胞的選擇性殺傷作用。本文重點對NDV誘導宿主細胞分泌的細胞因子及其作用進行綜述。

細胞因子是機體抗腫瘤機制的重要組成部分,可在很大程度上改善腫瘤的微環境,在局部可增強特異性 T細胞對腫瘤細胞的免疫應答,增強N K細胞的殺傷活性[2-3]。NDV具有很強的非特異性免疫刺激作用,感染后能夠活化宿主細胞,在細胞表面誘導產生白細胞介素(Interleukin,IL)、腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF)、干擾素 (Interferon,IFN)、集落刺激因子(Colony Stimulating Factor,CSF)、一氧化氮等細胞因子和局部趨化因子,這些細胞因子均有直接或間接的抗腫瘤作用,可進一步增強NDV的抗腫瘤功能。

1 白細胞介素(Interleukin,IL)

白細胞介素可由淋巴細胞、單核細胞等多種細胞產生,在細胞間相互作用、免疫調節、造血及炎癥過程中發揮著重要作用,并且白細胞介素可以活化淋巴細胞和巨噬細胞,提高機體的免疫功能,從而殺傷腫瘤細胞。研究證明,NDV感染機體后可誘導機體免疫細胞產生的白細胞介素有 IL-1、IL-2、IL-6等,至于NDV感染是否可引起其他種類的白細胞介素的分泌則未見相關報道。

1.1 白細胞介素1 IL-1主要由活化的單核巨噬細胞產生,有IL-1α和 IL-1β兩種不同的分子形式。IL-1具有炎癥介質的作用,對機體的免疫具有啟動、放大效應和正向調節作用,對多種腫瘤細胞的生長具有抑制效應,與 IL-2或干擾素協同可以增強N K細胞活性。早在1997年就有學者[4]給小鼠腹腔接種NDV后,分別在接種后的1 h、2 h、4 h,用反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)方法檢測感染NDV小鼠脾臟內細胞因子的mRNA,發現機體在感染NDV 2 h后即可出現 IL-1α和 IL-1β的 mRNA,從而誘導機體產生 IL-1α和 IL-1β,即使使用滅活的NDV,依然可以檢測到 IL-1β的分泌。但是當時他們只證實了NDV感染后可以誘導 IL-1的產生,至于產生的IL-1在NDV的抗腫瘤中究竟起到什么作用,其對腫瘤細胞有什么抑制作用,并未做更深入的研究。

1.2 白細胞介素2 IL-2是白介素家族中的重要成員之一、機體免疫調節網絡中的核心物質,又被稱為T細胞生長因子(T cell growth factor,TCGF),主要由CD4+和CD8+T細胞產生,可以自分泌或旁分泌方式發揮效應。IL-2可促進 T、B等免疫細胞的增殖分化,增強N K細胞的殺傷活性,誘導LA K細胞生成并促進其活化,另外,IL-2還可促進其他細胞因子如干擾素、腫瘤壞死因子等的分泌以及抗體的產生。此外,有研究發現,IL-2可通過上調Fas受體及抑制Fas相關磷酸酶的表達而促進結腸癌細胞的凋亡[5]。NDV具有誘導生成 IL-2的作用[6],但是直接研究NDV誘導產生的IL-2發揮抗腫瘤作用的報道卻為數不多,對于 IL-2的研究,多數學者側重于導入外源性IL-2基因的重組NDV的抗腫瘤研究,并且取得了一定的進展。將人IL-2基因作為外源基因整合到NDV基因組中,用其感染腫瘤疫苗后,通過腫瘤中和試驗,發現可刺激 T細胞發揮抗腫瘤活性,此種效應與不含 IL-2基因的NDV相比顯著增強,即NDV固有的免疫刺激作用可以通過引入治療性的 IL-2基因來進一步的增強[7]。Zamarin D等人[8]將鼠IL-2基因插入NDV基因組中的P基因和M基因之間,構建了表達 IL-2的重組NDV(NDV(F3aa-IL-2)),給C57/BL6小鼠預防性皮下或靜脈接種NDV(F3aa株)、NDV(F3aa-IL-2),然后給各組小鼠皮下注射小鼠B16/F10黑色素瘤細胞,成瘤后,分別給荷瘤小鼠瘤內注射 PBS、NDV(F3aa)、NDV(F3aa-IL-2),25 d后PBS組8只小鼠腫瘤顯著,NDV(F3aa)組13只小鼠僅有2只小鼠可見腫瘤,但瘤體積明顯小于 PBS組,NDV(F3aa-IL-2)組小鼠未檢測到腫瘤。此結果說明了與注射 PBS組和注射 NDV(F3aa)組相比,NDV(F3aa-IL-2)有明顯的抗小鼠惡性黑色素瘤作用。他們還觀察了NDV(F3aa-IL-2)長期的抗腫瘤效應,發現表達 IL-2的重組 NDV(NDV(F3aa-IL-2)),可顯著提高小鼠的總體生存率(與 PBS對照組相比P=0.0002,與 NDV(F3aa)組相比P=0.0498)。

1.3 白細胞介素6 IL-6是機體免疫網絡中最重要的細胞因子之一,主要由單核巨噬細胞分泌,部分來自于 T細胞、B細胞、成纖維細胞和血管內皮細胞。在天然情況下,IL-6可以通過旁分泌和自分泌形式在局部發揮作用,但是在某些病理情況下,如急性炎癥時,也可通過內分泌形式在全身發揮作用。IL-6有著非常復雜的生物學功能,可通過影響細胞的粘附性、活動力、血栓形成、腫瘤特異性抗原的表達及腫瘤細胞的增殖而影響腫瘤的進展[9]。IL-6對腫瘤的生長有雙向調節作用,可根據腫瘤細胞的類型及其表面是否有IL-6受體,表現為抑制或促進腫瘤細胞的增殖。對前列腺癌細胞,IL-6可通過激活JA K-STA T3信號傳導通路實現對其生長的抑制作用[10]。對頸部腫瘤IL-6可通過激活VEGF-A介導的血管新生促進其生長[11]。有研究證明了NDV可以誘導機體免疫細胞分泌 IL-6[4,12],那么,NDV誘導分泌的IL-6對腫瘤細胞究竟是抑制還是促進呢?有關此類研究的報道較少。張琪等人通過構建S37腫瘤鼠模型,用 HE染色和免疫組化的方法對NDV治療腫瘤時瘤組織中IL-6的動態表達進行了研究,發現在腫瘤組織壞死區,IL-6表達很弱甚至不表達,而在生長旺盛的腫瘤組織,治療組IL-6表達呈強陽性。治療組 IL-6的表達隨著腫瘤組織的變化,呈現由陽性到強陽性再到陽性的變化,這表明了NDV在治療腫瘤的過程中,能促使機體產生大量的細胞因子參與機體的抑瘤作用,并且有可能參與了腫瘤細胞的壞死及凋亡過程[13]。

2 腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF)

TNF具有抗炎、抗休克、抗腫瘤等多種生物學活性[14],TNF通過與靶細胞膜上的TNF受體結合后,可激發細胞內的一系列信號傳遞,引起鈣離子濃度增加,激活核酸內切酶,導致DNA降解、細胞凋亡。TNF抗腫瘤機制主要有對腫瘤細胞的直接毒性、對腫瘤血管結構效應及宿主抗腫瘤機制的激活等幾個方面。TNF有兩種類型 TNF-α和 TNF-β。TNF-α是由被激活的巨噬細胞產生的有多種活性的多肽類細胞因子,是迄今為止發現的抗腫瘤作用最強的生物因子,是宿主的重要防衛機制之一[15-16],TNF-α的抗腫瘤作用主要表現在誘導腫瘤細胞凋亡、破壞腫瘤組織血管、放化療免疫增敏作用、介導免疫調節作用等。TNF-β又稱為淋巴毒素(lymphotoxin,L T),由活化的 T細胞和N K細胞產生,它與 TNF-α有結構上的同源性和功能上的相似性,TNF-β能殺死某些腫瘤細胞或者抑制其增殖,其機制可能是直接殺傷或抑制腫瘤細胞、調節機體免疫功能、損傷內皮細胞或導致血管功能紊亂,造成腫瘤組織的局部血流阻斷而發生出血、缺氧壞死[17]。對于NDV誘導 TNF-β分泌并發揮抗腫瘤效應的報道較少,大量文獻表明 NDV可以誘導TNF-α的產生并發揮抗腫瘤效應。Huang C等人[18]通過構建人結腸癌裸鼠移植瘤模型研究NDV D817毒株的抗腫瘤效應,采用NDV D817高、中、低三個劑量,觀察不同劑量NDV D817對移植瘤的抑制作用,使用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒檢測荷瘤小鼠體內 TNF-α的含量,結果發現中劑量NDV D817可明顯抑制移植瘤的生長,抑制率達48.1%,NDV D817具有誘導腫瘤細胞凋亡和誘導機體產生 TNF-α的作用。但是NDV D817誘導腫瘤細胞凋亡是否與誘導 TNF-α產生有關,并未進一步研究。白蓮花等人用新城疫病毒L系(NDV-L)作用于小鼠腹腔巨噬細胞 PEMФ,結果發現NDVL可誘導小鼠 PEMФ產生 TNF-α,并且產生 TNF-α的量與NDV-L作用的時間和劑量有一定的關系,當NDV-L感染劑量一定時 TNF-α的釋放量在NDV-L作用24h時最強。用3H-脫氧胸苷(3HTdR)標記腫瘤細胞做 TNF-α的細胞毒實驗,表明其具有明顯的殺傷活性。將NDV-L處理的PEMФ靜脈轉輸給B16黑色素瘤荷瘤小鼠,發現對肺轉移有明顯的抑制作用(P<0.01)。此項研究說明了NDV-L可以誘導小鼠 PEMФ產生 TNF-α,并且產生的 TNF-α具有明顯的細胞毒作用,在體內具有明顯的抑制肺轉移的作用[19-20]。NDV不僅可以誘導人單核細胞產生 TNF-α,并且其感染腫瘤細胞后能增強腫瘤細胞對 TNF-α溶細胞效應的敏感性[21]。

3 干擾素(Interferon,IFN)

干擾素是一類具有廣泛的抗病毒、抗腫瘤和免疫調節等作用[22]的細胞因子,也是最先被發現、最早被應用于臨床的細胞因子。依據其來源、受體、應答途徑和效應的不同可分為Ⅰ型和Ⅱ型干擾素:IFN可以通過促進機體免疫細胞功能,提高巨噬細胞、N K細胞以及細胞毒性 T淋巴細胞(CTL)的殺傷能力來發揮其抗腫瘤作用。NDV可以誘導IFN-α、IFN-β、IFN-γ的產生[4,23-24],并且即使無復制活性的NDV也可以使人外周血單核細胞分泌 IFN-α增加[25]。IFN-α的抗腫瘤機制主要有直接作用于腫瘤細胞和間接調節免疫功能兩個方面,間接調節免疫功能的主要途徑就是促進腫瘤壞死因子家族介導的細胞凋亡。IFN-α可以通過激活JA K-STA T途徑誘導 TRAIL(TNF-related Apoptosis-inducing Ligand)等分子的表達,還可以增強 FasL表達,TRAIL與FasL與腫瘤細胞表面的相應受體結合后,通過信號轉導可以啟動caspase級聯反應,最終裂解核蛋白、細胞骨架、內質網等誘導腫瘤細胞凋亡。另外,IFN-α還可在轉錄水平增強 P53[26]、Bax[27]等凋亡相關基因的表達,來增強它的抗腫瘤功能。NDV具有強大的 IFN-β誘生能力,陳輝等人[28]選用3株人肝細胞系 PH5CH8、Huh7、Hep G2作為研究對象,使用NDV與多聚次黃苷酸-胞苷酸〔poly(I:C)〕作為 IFN-β誘生劑處理上述3種細胞,從轉錄、蛋白水平及功能學角度檢測產生 IFN-β的能力。結果顯示,PH5CH8細胞經NDV誘導后,IFN-β水平升高了327.20倍。IFN-γ則可以通過直接抑制腫瘤細胞、增強宿主對腫瘤細胞的免疫反應等途徑干擾宿主與腫瘤間的相互關系等方面來發揮抗腫瘤作用[29]。另外,IFN-γ還可以通過抑制腫瘤血管生成來抑制腫瘤轉移[30]。IFN與IL-2、TNF具有相互協同促進作用,IL-2誘導N K細胞活化增殖后可引起 TNF和 IFN-γ的釋放,TNF和腫瘤細胞膜上的TNF受體結合后可以直接或間接破壞腫瘤細胞,IFN能上調腫瘤細胞表面的 TNF受體的表達而協同 TNF抗腫瘤,IFN與IL-2、TNF均可促進FasL的表達,而FasL與靶細胞表面上的 Fas分子相互作用,啟動信號傳導過程,導致靶細胞內源性自殺程序激活,是誘導靶細胞凋亡的主要途徑之一。NDV誘導產生的IFN、IL-2與 TNF是否可以通過此途徑協同作用來間接促進NDV的抗腫瘤作用,仍然需要我們進一步的研究。

4 集落刺激因子 (Colony Stimulating Factor,CSF)

集落刺激因子是指能夠刺激多能造血干細胞和不同發育分化階段的造血干細胞進行增殖分化,并在半固體培養基中形成相應集落的細胞因子。集落刺激因子種類繁多,包括巨噬細胞集落刺激因子(macrophage-CSF,M-CSF)、粒細胞集落刺激因子(granulocyte-csf,G-CSF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、多重集落刺激因子(multi-CSF,即IL-3)、干細胞生長因子(stem cell factor,SCF)、紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)以及血小板生成素(thrombopoietin,TPO)等。將外源性 GMCSF基因導入腫瘤細胞中可以促進APC的成熟,并且提高其對腫瘤抗原的遞呈和加工處理能力[31,32]。NDV可以誘導 GM-CSF和M-CSF的分泌[4],并且NDV的固有抗腫瘤作用和免疫刺激作用可以通過引入外源性的 GM-CSF基因來進一步的增強,同時伴隨著IFN-α的分泌量顯著增加[33]。

5 一氧化氮(Nitric Oxide,NO)

NO是生物體內一種結構簡單的自由基,是機體內重要的信使分子和效應分子,具有重要的生理功能,在殺傷腫瘤方面有重要意義,是活化的巨噬細胞殺傷腫瘤細胞時產生的毒性效應因子之一。對于NDV可以誘導NO分泌以及誘導分泌的NO的抗腫瘤作用,國內外許多學者分別從體外、體內等方面進行了大量的研究。Umansky等人[34]在體外實驗中發現NDV作用人的外周血單核細胞后產生NO,釋放出來的NO與NDV殺傷腫瘤細胞有密切的關系,NO可導致巨噬細胞核的NF-κB因子活化,從而活化巨噬細胞。將NDV-L作用于人外周血粘附性單個核細胞(a-PBMCs)2～4 h后,可發現NDV-L相對穩定地吸附在其表面,并誘導其釋放一氧化氮,而且NO的釋放量與病毒滴度有關,當病毒滴度在10-6～10-9時,NO的分泌量維持在一個相對穩定的高水平。使用3H-TdR釋放法測定NDV-L作用的a-PBMCs對 K562細胞的細胞毒活性,發現具有明顯的殺傷效應,并且殺傷效應與NO的產生有一定的依賴性[35]。Schirrmacher U等人[36]使用2種不同的NDV毒株、不同來源的巨噬細胞、不同的鼠系(DBA/2,C57BL/6,615)在不同的條件下研究NDV體內外激活鼠巨噬細胞的抗腫瘤活性的能力時,發現有抗腫瘤作用的效應物質如NO、TNF-α的產生。

6 其他細胞因子和趨化因子

唐省三等人以人膀胱癌EJ細胞株為靶細胞,研究NDV對體外腫瘤細胞的抑制作用機制時,使用免疫組化的方法檢測到 TGF-β1表達增加,TGF-β1與其受體或抑制成分結合蛋白結合而誘導膀胱癌細胞凋亡[37]。

NDV具有誘導 T細胞共刺激活性、防止無能誘導以及誘導局部趨化因子如RAN TES、IP10等的作用,T細胞通過趨化因子聚集于接種局部,導致腫瘤特異性 T淋巴細胞活化,此種特異性 T淋巴細胞有兩型,一是記憶細胞,另一是初始 T細胞,此兩種細胞活化后產生腫瘤特異性記憶 T細胞,重新參與體循環,再一次接觸腫瘤相關抗原。就可以通過介導細胞因子和趨化因子的產生而誘導局部抗腫瘤免疫反應,新產生的這些因子又可以進一步聚集其他 T細胞,最終消滅腫瘤細胞[38]。

綜上所述,NDV誘導分泌的抗腫瘤作用相關細胞因子種類繁多,它們之間的關系也很復雜,我們知道,細胞因子發揮作用具有多效性和重疊性的特點,而且不同細胞因子之間具有協同和拮抗的作用,其合成和分泌相互調節,受體表達相互調控,共同組成了復雜的細胞因子網絡來發揮其作用。如文中所述,IFN與IL-2、TNF具有相互協同促進作用:IL-2可以促進干擾素、腫瘤壞死因子等的分泌,IFN能上調腫瘤細胞表面的 TNF受體的表達而協同 TNF抗腫瘤,另外,IFN與 IL-2、TNF均可上調 FasL的表達,細胞因子之間通過這種互相協同促進作用可使其抗腫瘤效能進一步放大。但是,NDV誘導產生的眾多細胞因子之間具有什么協同或拮抗的作用呢?目前此類的研究較少,關于NDV誘導細胞因子的研究主要是研究NDV誘導某種或某幾種細胞因子后的抗腫瘤作用觀察,或者是NDV與某些細胞因子聯合應用后的抗腫瘤效果對比。

7 問題與展望

NDV抗癌活性顯著,目前很多人致力于研究NDV的抗腫瘤機制,但是從NDV誘導細胞因子的角度來觀察其抗腫瘤作用的研究卻為數不多。而且就目前的研究形勢來看,針對NDV誘導產生某一種或幾種細胞因子后的抗腫瘤作用的研究較為常見,對NDV誘導產生的眾多細胞因子抗腫瘤途徑的研究則為數不多,特別是對這些細胞因子之間的聯系、協同作用的研究非常有限。所以至今我們對NDV誘導產生的眾多細胞因子之間的相互作用、信號轉導以及它們是如何系統地完成整個抗腫瘤過程的,仍然缺乏一個完整的認識。NDV誘導產生的眾多細胞因子之間有何關聯?它們之間是如何協同或拮抗的?它們在NDV抗腫瘤機制中到底扮演了一個什么角色?以及還有沒有我們沒有發現的NDV誘導的抗腫瘤相關細胞因子?這些問題仍然需要我們進一步的研究。

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