假肥大型肌營養(yǎng)不良患者骨骼肌纖維再生病理特點研究

趙清石 鞠浩 劉海燕 劉川 李海平

假肥大肌營養(yǎng)不良是一組因肌肉缺乏抗肌萎縮蛋白，引起的進行性肌肉變性疾病，為X連鎖隱性遺傳，分為杜興型肌營養(yǎng)不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）和貝克型肌營養(yǎng)不良（Becker muscular dystrophy，BMD）[1]。主要表現(xiàn)為緩慢進行性加重的對稱性骨骼肌萎縮和無力，最終完全喪失運動功能。其病理以肌纖維的變性、壞死和再生為主要表現(xiàn)[2]。其發(fā)病機制雖得到公認(rèn)，但對于該病尚無有效的治療方法。研究該病肌纖維再生特點，探索肌纖維再生的相關(guān)因素具有重大意義。本實驗收集1998～2008年間臨床及病理診斷明確假肥大型肌營養(yǎng)不良患者骨骼肌標(biāo)本25例，研究其肌纖維再生特點。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 假肥大型性肌營養(yǎng)不良25例，其中DMD18例、BMD7例。DMD患者按年齡分為三組：3～6歲組、7～8歲組、9～13歲組，每組6例。再生肌纖維用NCAM標(biāo)記，觀察各組年齡、病程及再生肌纖維個數(shù)。肌營養(yǎng)不良的診斷均確立在臨床、病理及實驗室檢查基礎(chǔ)之上[1]。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本獲得 2％利多卡因局部麻醉，肱二頭肌開放式骨骼肌活檢。

1.2.2 標(biāo)本處理 液氮/異戊烷冷凍，7μm連續(xù)冰凍切片。

1.2.3 組織化學(xué)及免疫組織化學(xué)染色分析 組化為HE染色，觀察再生肌纖維特點。

免疫組化采用ABC免疫組織化學(xué)染色。試劑包括鼠抗人NCAM單克隆抗體（1∶50，美國 Santa Cruz Biotechnology公司產(chǎn)品）；動物血清（馬血清，中美合資蘭州民生海洋生物有限公司）；ABC試劑盒（美國Vector Laboratories公司產(chǎn)品）。

1.2.4 形態(tài)計量學(xué)分析 200倍光學(xué)顯微鏡下完成對再生肌纖維的定量，每個活檢標(biāo)本至少有兩張切片參加計數(shù)，每張切片再生肌纖維數(shù)量的評估至少在6個顯微鏡視野內(nèi)完成，以每單位視野面積中NCAM陽性肌纖維數(shù)表示再生肌纖維（fibers／200倍視野），應(yīng)用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報告分析系統(tǒng)版本9.0，通過圖像分析和計算測得再生肌纖維面積、直徑。以獲得數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，得出再生肌纖維平均直徑、平均面積情況。

表1 NCAM染色下神經(jīng)肌肉疾病再生肌纖維形態(tài)定量分析

表2 DMD患者年齡分組（NCAM標(biāo)記再生肌纖維）

表3 DMD患者年齡分組再生肌纖維統(tǒng)計表

圖1 DMD HE染色×200

圖2 DMD NCAM染色×200

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)方法每個標(biāo)本的再生肌纖維值取其各個顯微鏡視野平均值。各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析：用單因素方差分析（ANOVA）進行多組間均數(shù)比較，組內(nèi)均數(shù)兩兩比較用方差分析進行多重比較（q檢驗）。

2 結(jié)果

2.1 再生肌纖維病理特點 在HE染色中，DMD患者骨骼肌肌纖維大小不等，可見大量變性、壞死和再生肌纖維，壞死呈灶性分布，結(jié)締組織增生。BMD病理改變較DMD輕，變性、壞死和再生散在，結(jié)締組織不同程度增生。NCAM作為再生肌纖維的標(biāo)記物，通過HE染色和抗NCAM單克隆抗體染色同源纖維比較，觀察到HE染色下再生肌纖維深染，胞質(zhì)嗜堿性深染，細(xì)胞核大；NCAM染色可見再生纖維越幼稚，染色越深，晚期再生染色淺，成熟肌纖維、炎性細(xì)胞和結(jié)締組織均不著色（圖1、2）。假肥大型肌營養(yǎng)不良再生肌纖維形態(tài)基本相同，但是肌纖維再生活躍程度不同：DMD再生活躍，發(fā)病年齡均較小；BMD再生不活躍，且年齡偏大，肌纖維直徑大。

2.2 再生肌纖維形態(tài)計量學(xué)分析 使用光學(xué)顯微鏡在200倍下觀察，對活檢標(biāo)本進行計數(shù)，每個標(biāo)本至少選取兩張切片，每張切片至少選取6個顯微鏡視野進行再生肌纖維數(shù)量的評估，以每單位視野面積中NCAM陽性肌纖維數(shù)表示再生肌纖維（fibers／200倍視野），應(yīng)用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報告分析系統(tǒng)版本9.0，通過圖像分析和計算測得再生肌纖維平均面積、平均周長和平均直徑（表1）。可見BMD患者再生肌纖維明顯大于DMD患者再生肌纖維（表2）。DMD患者隨年齡增長再生肌纖維數(shù)量逐漸減少（表3）。

3 討論

骨骼肌纖維在受到化學(xué)、物理及機械損傷時具有旺盛的再生能力，研究肌纖維再生過程、肌纖維再生的相關(guān)因素是解決肌病基本特別是肌營養(yǎng)不良治療的重要手段[3]。假肥大型肌營養(yǎng)不良是一組遺傳性疾病，兒童早期起病，迄今尚無有效治療手段。對于假肥大肌營養(yǎng)不良，特別是DMD，大量實驗發(fā)現(xiàn)其再生活躍，因此探索其再生特點，尋找促進其肌纖維再生、成熟的因素具有重大價值。

本研究可見假肥大型肌營養(yǎng)不良再生肌纖維形態(tài)基本相同，但是肌纖維再生活躍程度不同。DMD患者普遍年齡較小，骨骼肌病理發(fā)現(xiàn)其再生較活躍。BMD患者年齡多較DMD偏大，再生活躍程度較DMD差。同時本研究表明DMD患者骨骼肌纖維再生隨年齡增長再生亦逐漸減弱。國外研究表明[4]，正常情況下，哺乳動物骨骼肌有很好的自我修復(fù)能力，都會隨著衰老而發(fā)生萎縮，這可能是常年正常使用時引發(fā)的損傷未能及時修復(fù)的積累結(jié)果。隨著年齡的增加，損傷后肌肉的再生能力也將降低，肌肉正常再生能力跟不上過度受損的速度，導(dǎo)致出現(xiàn)肌肉的無力及萎縮，這可能與肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)目減少和（或）增殖能力的減弱有關(guān)。有研究表明，在再生中起重要作用的衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量在肌病患者1歲左右開始增加，3～9歲達(dá)高峰[5]。本實驗發(fā)現(xiàn)DMD患者8歲前再生較8歲后明顯活躍，可能由于肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖分化，不能彌補肌營養(yǎng)不良患者肌肉修復(fù)過程中由于不斷激活而導(dǎo)致的衛(wèi)星細(xì)胞池的衰竭。在DMD患者中，衛(wèi)星細(xì)胞增殖加強的地方，端粒（細(xì)胞反應(yīng)年齡的指示器）的長度與正常老年人一樣都過早縮短。而且，在動物模型中，隨著年齡的增長或重復(fù)的再生，衛(wèi)星細(xì)胞的增殖潛能減弱[6]。因此可以解釋我們的實驗中，在年齡小的患者的肌纖維再生較年齡大者活躍。因此假肥大型肌營養(yǎng)不良易及早治療，早期促進肌纖維再生，減少肌纖維變性、壞死具有重大意義，當(dāng)達(dá)到一定年齡后肌衛(wèi)星細(xì)胞池耗竭時，再行治療在某種程度上來講意義不大。

[1]沈定國.肌肉疾病[M].北京：人民軍醫(yī)出版社,2007：214-218.

[2]吳世文,馬維婭譯.臨床肌肉病理學(xué)[M].3版.北京：人民軍醫(yī)出版社,2007：40-50.

[3]Grefte S，Kuijpers-Jagtman AM，Torensma R，et al.Skeletal muscle development and regeneration[J].Stem Cells Dev，2007，16（5）：857-868.

[4]Buricchi F，Chiarugi P，F(xiàn)iaschi T，et al.During muscle ageing the activation of the mitogenic signalling is not sufficient to guarantee cellular duplication[J].Biochem,2005，54：258.

[5]Edstr m E，Altun M，Bergman E，et al.Factors contributing to neuromuscular impairment and sarcopenia during aging[J].Physiol Behav,2007,92（1-2）：129-135.

[6]Boncompagni S，Kern H，Rossini K，et al.Structural differentiation of skeletal muscle fibers in the absence of innervation in humans[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2007，104（49）：19339-19344.