增生性玻璃體視網膜病變動物模型的改進和評價

趙紅梅，盛敏杰，于 靖

（同濟大學附屬第十人民醫院眼科，上海 200072）

增生性玻璃體視網膜病變（proliferative vitreoretinopathy，PVR）是導致視網膜脫離手術失敗的主要原因之一。眼外傷或者視網膜破裂后，RPE細胞、müller細胞等從原位遷移至玻璃體腔發生增殖和收縮。在此過程中，細胞因子大量產生，膠原和纖維樣物質大量堆積，形成視網膜前膜或視網膜下膜，從而引起牽引性視網膜脫離，嚴重影響視力［1］。根據其病理過程，人們建立各種不同類型的PVR模型，以更好的研究該病的發病機制和防治。

1 模型中常用的動物

1.1 兔子

兔子因為性情溫順、眼球大，晶狀體相對小、玻璃體腔體積相對較大，便于進行眼科手術操作和觀察等優點而成為PVR模型中最常用的實驗動物。最常用的品種是新西蘭白兔、青紫藍兔、中國本種兔等。但是缺點是：兔子和人類的眼底構造稍有不同，兔子沒有黃斑中心凹，存在髓線。總體而言，PVR比較容易發生。

1.2 鼠類

大鼠和小鼠也可用于PVR模型，鼠類具有繁殖能力強、飼養管理方便，易于控制、遺傳基因組和組織解剖結構和人相似性高等優點。目前在PVR小鼠模型中應用最多的是C57BL/6J小鼠，常用于PVR大鼠模型中的封閉群有：Wistar、Spraque-Dawley大鼠、Brown-Norway大鼠，近交系有Lewis大鼠。大鼠和小鼠應用于此模型的缺點是：眼球體積小，晶狀體接近于球形，玻璃體腔體積相對較小，不易于玻璃體腔注射等操作，而且觀察不方便。

1.3 其他動物

小型豬、貓以及靈長類動物等也可用于PVR動物模型的建立，但是由于倫理、價格等原因而應用較少。

2 PVR動物模型的建立方法

為了研究PVR的病理發展過程和治療，現在已不止有25種模型的建立方法［2］。

2.1 玻璃體腔注入細胞

由于玻璃體腔注射后會發生高眼壓等并發癥，大多數學者在玻璃體腔注射之前會先行玻璃體切割，可以用氣體壓迫、手術機械性切割［3］等方式，也可以先注射透明質酸酶待玻璃體液化［4］，以利于細胞在玻璃體腔的移行，促進PVR的發生。PVR以及牽引性視網膜脫離的程度與注入的細胞數量呈劑量-效應關系，根據這一關系，可選擇出注入細胞的合適數量，制成相應的模型。

2.1.1 RPE細胞：這是PVR動物模型造模方法中最常用的方法之一。這種方法可以模擬RPE細胞在玻璃體內的增殖、移行和分化等過程，而且RPE細胞能分泌多種細胞因子，促進膠原和纖維的形成，形成明顯的視網膜前膜，很好的突出了疾病的本質，并且可以進行定性、定量研究，可重復性強。可以用自體同源、同種異體或者異種的RPE細胞。為了提高造模成功率也可以聯合富含血小板血漿或者müller細胞。

2.1.2 成纖維細胞：將成纖維細胞注入玻璃體切割后的眼內，也可制作成典型的PVR模型。成纖維細胞注入眼內后，就會以殘余的玻璃體膠原和透明質酸為支架生長繁殖，形成模樣物，牽拉下方的視網膜，造成后部PVR。成纖維細胞容易獲取，培養時生長良好。細胞可以取自自體或異體的皮膚［5］、結膜［6］等組織。異體和自體成纖維細胞的結果在時間和程度方面無差異。并且此模型容易重復，這種造模方法也備受青睞。

2.1.3 巨噬細胞：巨噬細胞是一種終末細胞，不能轉化和增生，但它們能分泌多種細胞因子。將巨噬細胞注射到玻璃體腔也能形成PVR動物模型［7］。在此模型中，眼內的增生細胞如RPE細胞等均來自宿主自身，這種模型以炎癥啟動階段為起點，可用于觀察早期的炎性細胞因子的含量變化及對細胞增生的調控作用。而且巨噬細胞的采集和純化相對簡單。

2.1.4 神經膠質細胞：將神經膠質細胞注入大鼠玻璃體腔也可以建立PVR模型。Francine等［8］在大鼠玻璃體腔單一注射RPE細胞、müller細胞以及聯合注射，發現在大鼠PVR模型中，müller細胞誘導PVR的能力大于RPE細胞，而且聯合注射明顯優于單一細胞注射。

2.1.5 其他類型細胞：內皮細胞、軟骨細胞、胚胎細胞等也可以用于PVR建模［9］。但是由于此過程與PVR自然發病過程相距甚遠，實際應用較少。

2.2 玻璃體腔注射富含血小板血漿或富含血小板血漿聯合細胞

富含血小板血漿（platelet-rich-plasma，PRP）中富含大量的血小板，血小板可以分泌多種細胞因子，比如PDGF、TGF等，這些因子可以促進細胞的增殖、纖維的形成，促進纖維向視網膜粘附，形成PVR模型。

PRP聯合細胞注入玻璃體腔時，PRP中細胞因子的釋放對注入細胞有促增生、促粘附的作用，能更好的建立PVR模型。Zheng等［10］嘗試了在大鼠玻璃體腔單純注射RPE-J細胞、玻璃體腔單純注射PRP、玻璃體腔聯合注射RPE-J細胞和PRP三種方法來建立大鼠PVR模型，最后發現玻璃體腔聯合注射的建模成功率明顯高于單獨注射。

2.3 較大鞏膜切口制成的PVR模型

有鞏膜切口存在時，眼部的細胞如RPE細胞等直接暴露于玻璃體環境中，由于微環境的改變，RPE細胞發生遷移和增生，轉化成成纖維細胞，有收縮膠原和纖維的活性。與人孔源性視網膜脫離引起的PVR發生過程相似，聯合玻璃體腔注射細胞或者富含血小板血漿等操作能成功的建立PVR動物模型，但是外傷性PVR模型是人為的造成網脫，并不是由于玻璃體牽引引起的裂孔，而且手術操作復雜，影響因素較多，難以定量，病變程度的一致性和模型的可重復性較差。

由較大鞏膜穿孔傷以及眼后段穿孔傷制成的PVR模型與人外傷所致的PVR的發生相似，但這一模型由于血液存留在玻璃體內，使早期眼底窺不清，不利于早期觀察。

2.4 dispase酶消化法

dispase是細胞實驗時常用的一種分解組織的酶，可以選擇性的降解四型膠原和纖維連接蛋白，降解細胞外基質，為細胞的移行和分化創造條件。注射時，或多或少都有出血的發生，血液中的淋巴細胞、血小板等都參與了PVR的發生。Elizabeth等［11］首次報道了可以用dispase建立PVR模型，而且玻璃體腔或者視網膜下腔注射dispase，都可以成功建立PVR的兔模型，最佳劑量是0.05U～0.07U。dispase用量小，價格便宜，且建模操作簡單，對動物的創傷小，而且不需要引入外源的細胞成分，與臨床PVR更接近。但是這種造模方法有較多的副作用［12］，比如晶體脫位、白內障等。因為內界膜成分和基底膜非常相似，dispase分解基底膜的同時也破壞了內界膜的本身結構，使müller細胞足板暴露［13］，在使用dispase建立PVR模型時要考慮到這些副作用。

2.5 玻璃體腔注射細胞因子

細胞因子如IL-1β、PDGF等可以促進RPE細胞等的增殖、遷移、分化等活性，將其注射到玻璃體腔也可以造成PVR模型。Gregory等［14］在外力造成視網膜裂孔后，將IL-1β注入玻璃體腔，也可以造成兔PVR模型，但是這種造模方法由于引入了外源性的細胞因子，與臨床所見的PVR的發生發展過程較大差異，因此限制了這種方法的使用。

2.6 其他方法

Shizuya等將小鼠的晶體摘除，直接外力損傷RPE細胞層，也可以造成小鼠前部PVR模型［15］，但是模型與臨床PVR相差甚遠，應用有限；此外在鞏膜傷后向玻璃體腔注入全血［16］或者血小板［17］也能誘導PVR的發生，但是所需時間比較長，增生程度輕；也有學者用眼內異物造模，但是鐵等異物的存在會造成視網膜明顯的毒性作用；也可用轉基因［18］］的方法來誘導細胞因子的表達從而形成PVR，但此法對實驗操作技術的要求較高。

3 PVR模型評價方法和分級

3.1 模型的評價方法

PVR建模后一周內每天用直接眼底鏡或間接眼底鏡觀察眼底，之后每周觀察一次眼底，觀察周期一般是28d以上，眼底鏡檢查主觀性較強。也可以用眼科B超來輔助診斷有無PVR的發生，適用于兔子等眼球較大的動物，但是鼠類眼球小，一般的B超探頭難以分辨模型建立與否。也可以選擇用光學相干斷層掃描（optical coherence tomography，OCT）或者視網膜電圖（electroretinogram，ERG）來評價模型，此外，螺旋CT可以對兔眼PVR模型中增殖膜的密度等進行定性和定量分析［19］。在諸多方法中，最客觀的評價方法是組織病理切片，可以從組織學角度客觀的評價模型建立與否。

3.2 模型的分級

在兔PVR模型的分級中，應用最多的是Fasternburg分級標準［20］。該標準共有五個等級：I級眼底正常，玻璃體內可見增殖條帶；Ⅱ級局灶性牽拉，局限性血管改變，充血擴張等；Ⅲ級髓線處的局限性網脫以及視網膜皺褶；Ⅳ級廣泛的視網膜脫離，全部髓線脫離，視盤周圍視網膜脫離；Ⅴ級視網膜全脫離、對折以及裂孔形成。

Weiss等［21］將兔PVR模型按照病變程度分為六級：0級無增生；0.5級玻璃體勉強可見增生痕跡；1級有細小增生束，但無真正的條索形成；2級有濃厚的增生束形成；3級有細薄的增生條索；4級有濃厚的增生條索。

我國的梁厚成等［22］也制定了兔PVR模型的分級標準：0級：眼底正常未見增生；I級：玻璃體內有少量纖細的增生條帶；Ⅱ級：玻璃體內有較多粗大的增生條帶；Ⅲ級：玻璃體內有膜狀增生條帶；Ⅳ級：增生條帶牽拉髓線抬高，或有局部視網膜脫離。

Francine等［8］制定了Lewis大鼠PVR的分級標準：0級無增殖反應；1級玻璃體內增殖；2級視網膜前膜以及視網膜皺褶形成；3級視網膜前有致密白膜形成，視網膜皺褶、局限性網脫，伴有或不伴有局限性后囊膜型白內障。

Zheng［10］制定了Wistar大鼠PVR模型的分級標準：0級無增殖反應；1級玻璃體霧狀渾濁，增殖條帶形成；2級單個或者多個象限的視網膜皺褶；3級單個象限的視網膜前膜形成；4級兩個或兩個以上象限的視網膜前膜形成。

4 問題與展望

目前PVR模型的所用動物還是以兔子為多，且造模方法復雜，不同的造模方法建立的模型有差異。就實驗效果而言，聯合注射不同的細胞或者細胞和PRP聯合注射成膜率更高，就實驗操作而言，兔子玻璃體腔較大，易于觀察，而且單純玻璃體腔注射操作相對容易。實驗者要分析各種方法的利弊，從實驗目的著手選擇合適的實驗動物和實驗方法來建立PVR動物模型。相信以后會有簡單易行而又穩定的造模方法出現，以便更好的研究該疾病。

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