免疫組織化學染色技術常見問題的研究與探討

何新明 羅穎潔 楊 通 莫明聰 林云恩 劉桂紅 (廣州醫學院第一附屬醫院病理科，廣州510120)

自從1941年coons首先用熒光素標記抗體，檢測肺組織內的肺炎雙球菌獲取成功之后，后繼研究者創建了免疫組織化學技術。經過幾十年的不斷發展，從最初的直接免疫熒光標記方法，逐漸發展為免疫熒光組織化學技術、免疫酶組織化學技術、親和免疫組織化學技術和免疫金銀組織化學技術等。該方法具有特異性強，敏感性高，定位準確，形態與功能相結合等優點，已越來越多用于臨床的病理診斷、腫瘤性質的判斷、預后的評估及基礎科學的研究。

免疫組織化學(Immuohistochemistry)又稱免疫細胞化學。它是組織化學的分支，是用標記的特異性抗體(抗原)對組織內抗原(或抗體)的分布進行組織和細胞原位檢測技術。由于免疫組織化學技術是一多步驟、多環節、多因素影響的實驗技術，有很多干擾因素影響最終的檢測結果，從而導致誤判和誤診[1-4]。本文就影響免疫組化染色的主要因素以及產生假陰性或假陽性結果的相關因素及對策進行分析和總結。

1 免疫組化染色的影響因素

1.1 組織固定 抗原的保存和定位對于免疫組織化學檢測方法的精確性是至關重要的。及時和充分的固定是一切優良組織學切片的基礎。如果組織固定不良，則在其后的任何操作階段遇到問題均難以補救。

免疫組織化學技術要求盡量保持組織、細胞內物質接近于其生活狀態時的形態結構和位置。固定的目的不僅是使細胞內蛋白質凝固，終止或減少外源性和內源性細胞內分解酶的反應，防止組織細胞自溶，更重要的是最大限度地保存組織、細胞內物質的抗原性，使抗原不失活、不彌散。故免疫組化染色結果的穩定與否，首先取決于組織固定效果[5]。

在進行免疫組織化學反應前的組織固定時應注意:

1.1.1 固定的組織必須新鮮 組織取材后應該立即固定，應盡快進入固定液固定或入液氮冷凍保存。特別是在夏季，如果保標本不及時固定，組織容易收縮變形，并發生自溶現象。

1.1.2 針對不同抗原及染色方法選擇最佳固定液較好的固定液應該具有強滲透力，能迅速滲透入組織內部;其次不會使組織發生過度收縮變形，并能使組織內易觀察的成分得以凝固為不溶性物質;還要使組織達到一定硬度，有較好的折光率。

1.1.3 組織塊體積 組織塊的體積宜小而薄，一般用于免疫組化的組織大小宜為1.0 cm×1.0 cm×0.2 cm。組織太大，內部得不到充分固定，導致組織結構破壞，給切片帶來一定的困難，還增加非特異性染色，同時浪費試劑。

1.1.4 固定液的量 固定組織時，必須有足夠的固定液。一般為組織塊體積的10～15倍。固定用的容器必須足夠大，組織材料不要太多，避免組織中的水分滲出影響固定液的濃度。

1.1.5 固定時間 固定的時間要視組織塊的大小及固定液的種類、濃度、溫度而定。組織塊越大，固定時間越長;反之，組織塊越小，固定的時間越短。固定液的穿透力與濃度呈正比。10%中性甲醛、4%多聚甲醛最合適，乙醇最常用濃度為95%。在37℃或者室溫固定，適合于許多蛋白質、抗原，并能保持其與抗體的反應能力。70%的乙醇固定能力最強。固定的時間與溫度呈反比。一般固定液效果隨著溫度升高而加強，溫度一般在-70℃ ～37℃之間，以室溫22℃為常用。某些酶的固定要求在37℃以下進行，如用丙酮在-20℃ ～-40℃之間固定30分鐘最佳。對于臨床活檢標本，固定時間要求短?？傊潭ǖ臅r間應該根據條件而定。

1.1.6 固定后要充分沖洗，以減少染色時的人工假象[1]組織固定后，因固定液滲透到組織中，所以必須徹底沖洗，除去殘留的固定液，否則會影響下一步的脫水。特別對于長時間固定的標本應用流水沖洗，盡可能減少色素沉著。對于混合固定液固定的組織、更要及時沖洗，否則將影響免疫組織化學切片的質量，產生人工假象。

1.2 抗原修復 在固定的過程中，醛類固定劑與蛋白質發生結合，使蛋白質變性從而達到固定目的，但同時又使蛋白質之間發生交聯，引起蛋白質空間結構的改變，從而封閉了部分抗原決定簇，降低抗原與抗體的結合位點，從而影響到免疫組化結果[6，7]。因此，免疫組化的可靠性與組織切片中蛋白抗原的性質密切相關。

抗原修復技術可修復因固定而發生封閉的抗原，使被封閉的抗原重新暴露，以達到提高免疫組織化學染色結果的陽性表達率，極大地推動了免疫組織化學技術的發展，提高了免疫組織化學的可靠性。常用的抗原修復技術方法有酶消化修復法、熱修復法。

1.2.1 酶消化修復法 酶消化修復法是以化學的方式使醛基斷裂，暴露抗原決定簇的抗原修復法，也是最早應用的抗原修復方法，主要應用于細胞內、組織間抗原的修復。在操作的過程中應選擇最佳的消化酶濃度、染色時間，避免因濃度過高、時間過長處理后影響組織抗原的修復，并造成背景染色，最終影響結果。

1.2.2 熱修復法 熱修復法是在高溫條件下，通過抗原修復液中離子與蛋白質相互作用充分暴露抗原決定簇，是一種較為簡單、經濟的方法。按其操作方法可進一步分為高壓加熱、微波加熱及單純加熱。目前使用最為廣泛的是高壓加熱法，此法不僅可以修復變性的抗原，還可以使組織通透性提高，從而獲得良好的染色效果。影響抗原修復的因素有很多，所以在抗原修復的時候必須注意的問題有以下幾點:

1.2.2.1 pH值的應用范圍及選擇 應用于抗原修復的物質很多，但至今為止，大家公認的最好的抗原修復液還是檸檬酸鹽緩沖液pH6.0，據多年來的實踐認為，該液確實很好，它適合于大多數的抗原，在常規應用的臨床標記抗體中基本都適用，經用該液修復后的抗原表達增強，抗原的定性和定位很理想，結果不錯。但近來也有文獻報道，應用抗原修復液pH8.0的效果也不錯。

1.2.2.2 抗原修復時應選擇最佳溫度 據Masson等研究表明:70℃ ～90℃的溫度對沒有經固定的蛋白可發生變性，但經福爾馬林固定的蛋白，要使其發生變性，溫度必須在92℃以上。據實驗認為溫度在92℃ ～98℃之間，尤其在95℃最為合適，這是因為:①這種溫度未達到沸騰，切片不容易脫離載片;②能夠解離和破壞與蛋白交聯的甲醛醛鍵等，處理時可以隨意選擇和確定抗原修復的作用時間。

1.2.2.3 抗原修復液必須遵循自然降溫規律，否則效果不好或達不到抗原修復的目的 抗原修復持續時間過后，取出放于室溫中讓其自然冷卻，決不能為了爭取時間，強行用冰塊或冷水使其冷卻。這是因為當高溫中的抗原蛋白分子鏈脫離了其它的束縛或聯結，要有一個自然環境讓其自然放松下來，隨著溫度的降低，它們會慢慢地恢復原來的形態和構型。如果用冰塊和冷水強行使其降溫，松開后的蛋白分子肽鏈突遇降溫而固定下來，恢復不了原有的構型，達不到預想的效果。

1.2.2.4 盡量使用足量的抗原修復液 抗原修復的方法都采用加熱的方法，尤其是微波輻射加熱法，該法由于產熱快。液體容易揮發直至干涸。因此，應用于抗原修復的液體，一定要充足，防止切片干涸。用于抗原修復的切片，如果由于液體少而導致切片的干涸，則應丟棄切片，因為熱干涸的切片中的抗原是沒辦法補救的，因它是一種不可逆的現象。據實驗認為，用于微波輻射抗原修復的液體，量大可多至1 000 ml。應用大量的抗原修復液時，由于它的量較大，可延緩了液體的沸騰時間，增加了切片受微波輻射的量，對抗原修復將達到徹底。

1.3 抗體 免疫組化染色要想得到令人滿意的結果，抗體與相應抗原結合的質和量至關重要。在這一結合過程中，諸多因素發揮著作用，如抗體的質量、最適濃度、孵育時間、溫度等等[8，9]。

目前國際上生產抗體的大公司一般都能保證產品質量，但需注意運輸、分裝、儲存都可能會影響到產品質量。一抗的濃度是免疫組織化學染色的關鍵，如過度稀釋會使抗原抗體結合的質量下降，而濃度過大又可抑制抗原抗體的結合。故在使用抗體時，市售抗體所附說明書標有的工作濃度僅作參考，須作“棋盤式效價”檢測以達到合適的稀釋度。通常以1∶30的比例開始稀釋，盡量找出最適稀釋濃度。稀釋的抗體不能長時間保存，4℃冰箱可存放1～3天，否則效價會明顯降低。近年國內外一些公司開發出即用型抗體，由于采取了特殊的穩定性處理，一般4℃保存效價穩定在1年以上，且可反復使用。抗體的孵育一般于37℃反應30～60分鐘(恒溫)或4℃冰箱過夜;對大部分抗體而言，37℃的反應條件其生物活性最強，有利于增強抗原抗體反應;但需注意必須在濕盒中進行，防止切片干燥而出現大片非特異染色。

1.4 顯色反應 免疫組化顯色是一種酶促反應，它通過連接在抗原-抗體復合物上的過氧化物酶與底物DAB發生反應，生成有顏色的復合物沉淀在組織細胞中的抗原部位。

當抗原與抗體充分結合并經檢測系統連結、放大之后，尚須經過酶促反應，即顯色反應。連結在抗原抗體復合物上的辣根過氧化物酶在過氧化氫的催化作用下與底物DAB發生化學反應，最后生成不溶性、棕黃色的DAB復合物而沉淀在組織細胞原位。在光鏡下可清晰地呈現出來。成功的染色應為組織背景清晰，定位明顯，核、漿、膜著色與臨床病理基本相符，DAB顯色的濃度與時間對顯色尤為重要，濃度過高、時間過長均會造成特異性染色深或假陽性。DAB顯色劑必需要現配現用，配好后最好在30分鐘以內使用，否則時間長了就會產生DAB顆粒;如組化片太多，建議可以分多次配用，否則DAB顆粒會沉積在切片上，影響結果的觀察。H2O2濃度也不宜太高，否則會加速反應，也可能增加背景染色。蘇木素復染時應徹底洗滌，充分藍化，這樣與DAB染色對照效果較好。DAB的顯色最好在顯微鏡下監控，達到理想的染色程度時立即終止反應，避免顯色過深，產生背景。

2 產生假陰性及假陽性的相關因素及對策

2.1 假陰性結果的原因

2.1.1 抗體已經失活或者本身達不到應有的敏感度。目前國內外的抗體，有時候都會有抗體不能顯示抗原的現象。

2.1.2 因保存不妥當，反復凍融，造成活性下降直至抗體效價下降。

2.1.3 抗原丟失或減弱，主要是在制片過程中某一階段處理不當而造成抗原的破壞，如固定時間過長，組織不夠新鮮、脫蠟不干凈或脫蠟后的切片擱置時間過長則可能呈假陰性。

2.2 假陽性結果的原因

2.2.1 抗體與多種抗原有交叉反應。

2.2.2 抗體與組織中某些成分的非特異性結合。如組織中正在壞死的細胞、膠原及嗜伊紅細胞等能非特異性吸附一抗，經過二抗放大后出現假陽性反應。

2.2.3 內源性酶封閉不夠充分，在顯色時候出現假陽性結果。

2.2.4 腫瘤或者病變中有其他的組織殘留，尤其是腫瘤中殘余極少的正常組織，而正常組織此時又有一定程度的增生或者萎縮，易將其誤認為是腫瘤組織。

2.2.5 異位抗原的表達。

2.2.6 陽性表達不在特定的抗原部位出現主要是抗原的彌散或者腫瘤細胞吞噬而使抗原在不該出現的部位表達。

2.3 避免出現假陰性及假陽性結果對策

2.3.1 陽性對照實驗 該法是用已經被免疫組化證實為陽性組織切片或者用某些組織必定含有的某些抗原或抗體的組織切片作為陽性對照，待檢的切片一起進行免疫組化染色，結果如下所示:①陽性對照片與待檢片同時呈現陽性，說明待檢片中含有與對照片相同的抗原或者抗體，此為正常結果;②陽性對照片出現陽性，而待檢片中出現陰性，說明待檢片中沒有含有與對照片相同的抗原或者抗體，也未正常結果;③陽性對照片和待檢片同時出現陰性，此為不正常結果，需另查找原因。

2.3.2 陰性對照實驗 該法是用以確定不含有待測抗原的組織切片，聯通待檢的切片一起進行染色，如對照片和待檢片同時出現陰性，說明該方法使用得當;如果對照片為陽性，則需要查找原因。

2.3.3 空白對照試驗 取出一張待檢片，不加一抗，用PBS代替一抗，結果出現以下三種結果:①對照片及待檢片均為陰性，對照片一抗用PBS代替，結果為陰性無可爭議性，而待檢片結果為陰性則應查證各種方法無誤后方可確定;②對照片出現陰性，待檢片出現陽性。此為預定結果;③對照片基待檢片均呈陽性，因為對照片不可能出現陽性，所以此為不正常結果，應該再查找原因。

2.4 避免對照組試驗出現異常結果應注意的問題

2.4.1 避免出現抗體效價下降 抗體的使用時間一般是在半年左右，一次用不完的抗體可保存在4℃條件下，不能在0℃以下保存，因為反復的凍融抗體會破壞抗體的生物活性，容易導致抗體的效價下降。如果不能在有效期內將抗體全部用完，則應該將其分裝數個Eppendorf管中，大致含20～50 μl，封上蠟膜后存放于-30℃條件下。此方法效果較好，保存幾年之久的抗體，其標記效果仍然很好。

2.4.2 正確使用二抗 目前常用的免疫組化方法主要是ABC和LSAB方法，這兩種方法中二抗有抗鼠和抗兔之分，所以必須正確地使用二抗。

2.4.3 選擇合適的抗體 目前的抗體有適合于石蠟切片的，有適合于冰凍切片的，還有一類是經僅使用冰凍切片的。所以必須要認真閱讀說明書，選擇合適的抗體。

2.4.4 配置pH值適當的緩沖液 一般的緩沖液pH值的使用范圍是7.2～7.6之間，過酸和過堿均會影響免疫組化的結果。

2.4.5 按照正確操作步驟 在操作過程中有許多的環節[10，11]，如固定時間是否過長，組織是否新鮮以及固定液的選擇是否正確。一般認為組織固定的時間在小于24小時，尤其是多聚甲醛，固定時間長，固定液變酸，會影響染色效果。醛類固定液體則主要靠與蛋白質交聯起固定作用，但這種交聯作用會造成細胞膜通透性下降，使抗原喪失抗原性，而且，醛類固定液的交聯作用具有高度pH依賴性，pH值高時交聯作用增強，組織表面的蛋白質被先固定，阻礙了其它固定液性中間進一步滲透，使中間的組織不能得到及時的固定，導致抗原發生彌散，所以選擇正確的固定液，如中性緩沖福爾馬林，可減少上述問題的發生。

綜上所述，我們認為，免疫組化操作雖然簡單，影響其質量的環節眾多，但只要我們嚴格按照規范的操作程序操作，出現問題及時系統分析和查找原因，以便找到有效的解決辦法，定能獲得理想的效果。

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