弓形蟲病疫苗研究進展

趙 蕾，于新友，王金良，李坤林

(1.山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東濱州 256600;2.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600)

弓形蟲(Toxoplasma gondii)是世界性分布的寄生原蟲，廣泛寄生于人體及動物的有核細胞內，引起嚴重的人獸共患病［1］。據估計全世界至少有1/3的人感染弓形蟲，成年人大多為隱性感染。弓形蟲是一種重要的條件致病病原體，為免疫功能抑制或缺陷者(如器官移植、惡性腫瘤及艾滋病人)致死的主要原因之一。弓形蟲也可引起禽畜疾病，給畜牧業生產造成嚴重的經濟損失。由于弓形蟲生活史復雜，傳播途徑多樣，對弓形蟲病的治療，特別是消滅弓形蟲的包囊，迄今為止尚未發現理想的防治藥物。因此，研制廉價、安全、有效的弓形蟲病疫苗是較好的防治措施。近年來，國內外在這方面做了大量的研究工作。

1 弓形蟲全蟲疫苗

1.1 死疫苗 弓形蟲死疫苗是由致死的蟲體或全蟲裂解物制備而成，免疫接種動物結果顯示，其抗感染能力弱。早在20世紀60年代，人們就對弓形蟲病預防接種進行了探討。Waldeland等用制備的弓形蟲滅活疫苗免疫小鼠，結果僅產生微弱的免疫保護性。Buxton等［2］用死的弓形蟲速殖子添加或不添加福氏佐劑免疫受孕綿羊，均不能使之免遭弓形蟲的攻擊。Stanley等［3］將弓形蟲速殖子的粗提物制成很小的微粒膠囊，經鼻免疫綿羊，結果產生了高水平的IgA、IFN－γ和細胞免疫應答，攻擊感染后產生IgG抗體，但不能提供完全的免疫保護性。Saavedra等［4］用人工合成的含有CpG序列的脫氧寡核苷酸(ODN)與弓形蟲的全部可溶性抗原混合在一起免疫BALB/c小鼠，結果產生典型的TH1型細胞介導的免疫應答，但免疫小鼠并不能抵抗弓形蟲RH標準株的感染攻擊。雖然死疫苗比較安全，但其抗感染能力弱，對人群和家畜無實用價值。

1.2 弱毒和減毒活疫苗 弓形蟲經紫外線、放射線以及化學試劑等處理后其毒力降低，而接種后又能保持一定的活力，激發較強的免疫應答。1992年，英國生物學家研制了一種活弓形蟲病疫苗，對綿羊進行了實驗，結果發現免疫后4周，綿羊體內大部分原蟲已不存在，第6周組織內找不到弓形蟲，一次預防接種可維持較長的免疫保護效應。弓形蟲減毒活疫苗的研究主要集中在Ts－4、T－263和S48。Ts－4溫度敏感株是由Preffecon分離的RH株突變體，其毒力明顯低于RH株且接種后不在體內持續存在。迄今包括小鼠在內的多種動物都用此種疫苗免疫接種，并證明具有抗致死性攻擊感染的保護性。但是這種疫苗可使哺乳小鼠及幼鼠死亡［5］。T－263具有抑制貓排弓形蟲卵囊的能力，對控制弓形蟲病傳播有重要意義［6］。S48弓形蟲速殖子接種綿羊可治療由弓形蟲引起的流產，有抗致死性攻擊感染的保護性［7］。減毒活疫苗能夠全方位調動機體的免疫反應，在抗弓形蟲感染方面有一定的實用價值，但此類疫苗經突變可恢復毒力，從而有潛在的危險。因此，該疫苗使用前景并不樂觀。

2 基因工程亞單位疫苗

利用DNA重組技術，將編碼弓形蟲保護性抗原的基因導入受體菌(如大腸埃希菌)或細胞，使其在受體中高效表達，分泌保護性抗原肽鏈。保護性抗原肽鏈經提取，加入佐劑即制成弓形蟲基因工程亞單位疫苗。弓形蟲亞單位疫苗候選抗原基因有P30(SAG1)，P22(SAG2)，P28，P23，速、緩殖子抗原，侵入促進因子(PEF)，54 ku膜蛋白，微線粒體抗原和致密顆粒抗原等。

2.1 單價疫苗 Makioka等將P30基因重組于3種不同的質粒載體中，導人大腸埃希菌，以不溶性的谷胱甘肽－S－轉移酶的形式高效表達SAG1抗原，用此重組抗原免疫小鼠，能激活巨噬細胞在體外殺傷弓形蟲的活性。Lunden等［8］引用 pGEX－6p－l構建原核表達載體PGEX－SAG1，并在大腸埃希菌BL21(DE3)菌株中進行表達，得到融合蛋白GSF－SAG1，純化切除GST標簽后得到重組蛋白rSAG1，免疫BALB/c小鼠2次，感染組小鼠1×103個弓形蟲速殖子感染。結果rSAG1免疫小鼠的脾細胞產生增殖，分泌IFN－γ，感染小鼠仔存活率達60%，且小鼠最少能存活28 d。未經免疫小鼠10 d內均發病死亡。陳曉光等［9］也在體外擴增并克隆了P30的編碼基因，并在大腸埃希菌中進行了表達。免疫印跡實驗顯示，該表達產物具有特異的免疫反應性。由于重組P30抗原在大腸埃希菌中的表達產物構型與天然蛋白往往差別較大，不能被抗天然P30蛋白的抗體有效識別。因此，要獲得與天然P30蛋白構型接近的重組蛋白就必須在真核系統中表達。但由于蛋白在原核細胞中表達不能折疊成天然構型，其分子結構、理化性質、生物學功能與天然蛋白均有差異，且難以分離。為了獲得效果更好的重組蛋白，Xiong等［10］將 SAG1基因和GST基因重組至辛得比病毒載體上，在真核細胞幼倉鼠細胞中進行了表達。其后，Kim等［11］將SAG1基因在中國倉鼠卵巢細胞(CHO)中表達了接近天然構型的SAG1蛋白，這些重組蛋白可被天然蛋白血清及人工免疫血清有效識別。嚴延生等［12］將SAG1基因在昆蟲細胞中進行了表達，純化出的重組SAG1也具有特異的免疫反應性。

2.2 復合多價疫苗 由于弓形蟲生活史較復雜，抗原成分多，每種抗原在體內誘導的免疫效應有所不同，動物和人體實驗均表明，單價亞單位疫苗的免疫效果不大理想。所以，發展多種抗原組合、針對不同生活史發育階段的復合多價疫苗是研究弓形蟲病疫苗的一個發展方向與共識，有助于克服單一抗原成分作為候選疫苗的不足［13］。Lunden等把弓形蟲P30(SAG1)、P22(SAG2)以及另一相對分子質量單位約6 ku的抗原制成免疫刺激復合物(ISCOMS)免疫綿羊產生了高滴度的抗體。陳海峰等［14］將P30抗原基因和棒狀體蛋白ROP2重組拼接克隆至原核表達載體，進行體外表達，結果顯示其免疫活性較強。古欽民等［15］把P30和P22兩種基因在體外重組后在大腸埃希菌中進行了表達。楊培梁等［16］通過截取 SAG1、GRA2、ROP2 抗原基因和霍亂毒素中含有T、B淋巴細胞表位的片段進行重組，構建了多表位疫苗，并在不同的表達系統中進行了表達，成功地構建了多表位基因的植物表達載體。除此之外，為了增強疫苗的免疫效果，將弓形蟲表面抗原與細胞因子或佐劑聯合制成復合疫苗亦是一個重要的研究方向。國內外一些研究者已將SAG1抗原基因和IL－2、IL－12和IFN－C等細胞因子以及明礬和經突變后無毒力的霍亂毒素(CTX)等佐劑進行體外重組，均不同程度地顯示了免疫活性，刺激機體產生保護性的免疫應答。同時，還將SAG1抗原分子與大腸埃希菌不耐熱毒素(LT)的變異體LTR72和LTK63粘膜佐劑、平喘藥沙丁胺醇以及能夠誘導TH1型細胞免疫反應的SBAS1等佐劑聯合應用對小鼠進行粘膜免疫，不僅能產生局部的免疫力，而且能誘導機體產生系統性免疫應答，顯著增強了機體免疫力。

基因工程疫苗有諸多的優點，但此類疫苗生產過程復雜，技術難度大，生產成本高，免疫活性亦不太理想，從而限制了此類疫苗的推廣應用。目前，尚未見到此類疫苗應用于人體的報道。近幾年來，核酸疫苗又成為國內外學者新的研究熱點。

3 核酸疫苗

核酸疫苗又稱為基因疫苗，或通稱為DNA疫苗，是20世紀90年代發展起來的新興技術，它是繼病原體疫苗、亞單位疫苗之后的第3代疫苗，基本原理是將編碼抗原的基因插入載體質粒中構成重組質粒，直接接種機體，達到抗感染的目的。弓形蟲病核酸疫苗是基于亞單位疫苗分子研究基礎上發展起來的，與傳統的疫苗相比，核酸疫苗無感染病原的危險，免疫作用類似活疫苗，可刺激機體產生全身性免疫應答，尤其是特異性的細胞免疫反應，而且容易與其他疫苗聯合使用，以增強免疫效果。目前，核酸疫苗技術已在利什曼原蟲、瘧原蟲等的疫苗研制中得到嘗試及應用，顯示出良好的保護作用，而弓形蟲核酸疫苗的研制尚處于起步階段。Augus等［17］構建了P30的重組表達質粒pCMVtoxo并將其以皮內及肌內兩種接種途徑免疫BALB/c小鼠，獲得一定的免疫力和保護力。

Nielsen等［18］構建了 pltPASAGA 質粒，可使80%～100%的免疫小鼠獲得抵抗弓形蟲RH株致死性攻擊的保護力。以致密顆粒抗原基因GRA1、GRA4構建的DNA疫苗在小鼠體內的研究中亦獲得了抗弓形蟲感染的保護性。Vercammen等［19］將編碼GRA1、GRA2以及R0P2基因的質粒免疫小鼠，結果產生了部分免疫保護性。Fachado等［20］將編碼P30－ROP2基因的pcDNA3質粒免疫小鼠，獲得了抗弓形蟲感染的持久的保護力。Mohamed等［21］將編碼弓形蟲熱激蛋白(HSP70)基因的質粒pME18100免疫小鼠，結果顯示其能明顯降低體內感染弓形蟲的數量，且此疫苗的療效能維持3個多月，同編碼弓形蟲SAG1基因的質粒免疫小鼠相比較，其保護性效果更加顯著。占國清等［22］將P30基因插入真核表達質粒PBK中，制備重組真核表達質粒PBK/P30，將該質粒直接免疫 BALB/c小鼠，結果顯示，免疫組小鼠CD8細胞數量明顯增多，CD4/CD8比率下降，說明此疫苗能誘導小鼠產生一定的細胞免疫應答。陳海峰等［23］將 SAG1和R0P2編碼基因片段克隆入PEGFP－N3表達載體，構建重組質粒，將此混合基因抗原用陽離子脂質體包被，肌肉注射免疫小鼠，發現該疫苗能誘導小鼠產生很強的細胞免疫和體液免疫，對弓形蟲的攻擊感染具有免疫保護作用。王丹靜等［24］用構建的重組質粒pcDNA3－HbsAg－GRA1經肌肉注射途徑免疫BALB/c小鼠，觀察pcDNA3－HbsAg－GRA1重組質粒誘導的保護性免疫。結果顯示，將GRA1與HBsAg融合明顯增強了GRA1的免疫原性和保護力。

最近，日本學者 Saito等［25］將編碼 SAG1抗原的質粒使用基因槍對小鼠進行皮內注射，隨后對接種處的皮膚進行同種異體移植，研究表明其能夠刺激機體產生治療性蛋白，有效地抵抗弓形蟲致死性攻擊。然而此種基因疫苗有效性的分子基礎還不清楚，尚有待于做進一步深入研究。

核酸疫苗在弓形蟲病疫苗的研究領域中已取得了比較可喜的成績，但是核酸疫苗的應用還存在著不少問題，主要是外源基因整合到宿主基因組中能否導致突變或激活癌基因;抗原在體內長期表達是否對免疫系統產生影響，是否會導致宿主的免疫耐受或自身免疫性疾病。這些都是核酸疫苗在實際應用中迫切需要解決的問題。

4 活載體疫苗

以病毒和細菌為載體的活疫苗是疫苗研究領域的一大發展趨勢，其原理是將外源目的基因插入已有的病毒或細菌疫苗株基因組或其質粒的某些部位使之高效表達，但不影響該疫苗株的生存與繁殖。接種這種重組疫苗以后，除對原來的病毒(或細菌)產生保護之外，還獲得對插入基因相關疾病的保護力。一般認為活載體疫苗在刺激保護性免疫方面優于其他基因工程疫苗。

楊秋林等［26］將弓形蟲的P30基因和ROP1分別導入乳酸乳球菌進行表達，動物實驗顯示，用含P30基因的重組乳酸乳球菌疫苗免疫過的BALB/c小鼠對弓形蟲的攻擊感染具有明顯的抵抗力，比對照組延長動物存活時間達8 d，而用含ROP1基因的重組乳酸乳球菌疫苗免疫過的BALB/c小鼠對弓形蟲的攻擊感染不具有明顯的抵抗力。李文姝等［27］觀察弓形蟲P30乳酸球菌口服疫苗誘導小鼠產生的細胞免疫效果和抗體IgG的動態過程。結果表明，P30乳酸球菌口服疫苗有效激發了小鼠細胞免疫反應，特異性抗體IgG在免疫結束1個月后生成明顯。Wang等［28］將弓形蟲棒狀體基因ROP2經穿梭表達載體電穿孔入卡介苗內，初步證實有一定的保護作用。高紅剛等［29］利用電穿孔技術將弓形蟲的P30、ROP2基因導入恥垢分枝桿菌M.S中，成功構建了復合基因重組載體活疫苗。Mack等［30］構建了弓形蟲的2種重組腺病毒AdCMVMuIFN－gamma和 AdCMVIL－12，將重組病毒 AdCMVMuIFN－gamma免疫BALB/c小鼠后，攻蟲9 d后，對照組全部死亡，免疫組死亡33%。而用重組病毒AdCMVIL－12免疫的BALB/c小鼠，攻蟲9 d后，對照組全部死亡，免疫組死亡40%。兩重組病毒免疫后都能延長動物的存活天數。Caetano等［31］構建了弓形蟲的3種重組腺病毒AdSAG1、AdSAG2和AdSAG3，將重組病毒免疫BALB/c小鼠后，結果表明，免疫小鼠對強毒弓形蟲RH株攻擊并沒有保護性，但當用P－Br株的弓形蟲速殖子進行攻擊時能觀察到實驗組動物腦中的包囊數明顯少于對照組。當用3種重組腺病毒同時免疫動物時，則免疫動物腦中的包囊數與對照組相比減少80%。Liu等［32］構建了表達弓形蟲SAG1基因的重組偽狂犬病病毒rPRV/SAG1，將重組病毒免疫BALB/c小鼠后，能誘導小鼠產生特異性的IgG抗體，產生較高水平的IL－2和IFN－γ，免疫小鼠感染弓形蟲后生存時間明顯延長，可使60%的免疫小鼠獲得抵抗弓形蟲RH株致死性攻擊的保護力。

5 展望

雖然弓形蟲病疫苗從最早采用的死蟲疫苗已發展到核酸疫苗及活載體疫苗，但其免疫保護作用還不盡如人意，因此有必要對弓形蟲與宿主之間的關系做深入研究，特別是針對弓形蟲各期所共有的保護性抗原及保護性表位的鑒定，將有助于有效疫苗的開發。雖然弓形蟲是單細胞生物，但其生活史的復雜性，形態的多樣性，入侵宿主的廣泛性，造成不同性質抗原的免疫特性及致病分子的機制均不同，復合型疫苗具有解決這些問題的潛力。核酸疫苗及重組活載體疫苗在實用性、安全性及有效性方面顯示出強大的優勢，能同時誘導機體產生高水平的保護性體液和細胞免疫力。因此，弓形蟲核酸疫苗及活載體疫苗將會成為今后的研究熱點。隨著生物信息學、分子生物學以及基因工程技術的日臻成熟、完善和發展，相信在不遠的將來，弓形蟲病疫苗的研制勢必會取得豐碩的成果。

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