高效液相色譜法檢測羊雞組織中氟苯達唑、噻苯達唑及其代謝物殘留量的研究

李 丹，張玉潔，汪 霞，應永飛，林仙軍，扎依達，賈新建，薛 毅，仲 鋒

(1.中國獸醫藥品監察所，北京 100081;2.浙江省獸藥監察所，杭州 310000;3.新疆獸藥飼料監察所，烏魯木齊 830063;4.中國動物疫病預防控制中心，北京 100026)

氟苯達唑、噻苯達唑屬于苯并咪唑類驅蟲藥，對牛、羊的肝片吸蟲、大片形吸蟲及前后盤吸蟲均有良好的殺滅效果，且毒性較小。因此從1960年開始已經廣泛應用于畜牧養殖業中［1］。噻苯達唑對大部分胃腸道線蟲，尤其是成蟲及特定的幼蟲有很好的驅蟲效果;氟苯達唑屬于抗蠕蟲藥，具有廣譜、高效的特點。氟苯達唑和噻苯達唑的廣泛使用在一定程度上對人類造成危害，因此必須采取有效的技術手段，對動物性食品中的有關藥物殘留進行檢測，以確保人類對動物性食品消費的安全。本研究旨在建立一種高效液相色譜法，可同時檢測羊組織(肌肉、肝臟、腎臟、脂肪)、雞組織(肌肉、肝臟)中氟苯達唑、噻苯達唑及代謝物2－氨基氟苯達唑、5－羥基噻苯達唑藥物的殘留。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑 Agilent 1100高效液相色譜儀(配紫外檢測器)，美國安捷倫公司;AE 240型分析天平;Biofuge Stratos高速冷凍離心機，德國賀利氏公司;乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)，美國Fisher公司;碳酸鈉、甲酸、鹽酸、氨水、乙酸銨、異辛烷、正丙醇、無水乙醇(分析純)，北京化工廠;氟苯達唑、2－氨基氟苯達唑、噻苯達唑、5－羥基噻苯達唑對照品，德國Adlershof Gmbh公司，含量均≥99.0%;MCX固相萃取柱(60 mg/3 cc)，Waters公司。

1.2 對照溶液的配制 氟苯達唑、2－氨基氟苯達唑、噻苯達唑和5－羥基噻苯達唑標準儲備液配制(1 mg/mL):稱取氟苯達唑、2－氨基氟苯達唑、噻苯達唑和5－羥基噻苯達唑對照品約10 mg，精密稱定，于10 mL量瓶中，加甲醇及滴加10%鹽酸溶液溶解后，用甲醇稀釋至刻度，制成濃度為1 mg/mL的標準儲備液，于－20℃以下保存，有效期6個月。

氟苯達唑、2－氨基氟苯達唑、噻苯達唑和5－羥基噻苯達唑標準工作液配制(10 μg/mL):準確量取標準儲備液0.1 mL，于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋成氟苯達唑、2－氨基氟苯達唑、噻苯達唑和5－羥基噻苯達唑10 μg/mL標準工作液。2～8℃保存，有效期1個月。

1.3 色譜條件 流動相 A相為0.02 mol/L乙酸銨溶液，B相為乙腈，梯度洗脫程序如表1所示。

色譜柱 Hypersil C18，250 mm ×4.6 mm(i.d)，粒徑 5 μm，或相當者;檢測波長 306 nm;柱溫40 ℃;進樣量 20 μL。

表1 流動相梯度洗脫表

1.4 組織樣品的提取與凈化 稱取(2±0.05)g試料，于50 mL離心管中，加2%碳酸鈉溶液0.5 mL、乙腈8 mL、異辛烷5 mL，渦旋混勻，中速振蕩5 min，5000 r/min離心5 min，取下層清液于50 mL雞心瓶中。殘渣再加2%碳酸鈉溶液0.5 mL、乙腈8 mL重復提取一次，合并兩次下層清液，加正丙醇5 mL。于50℃水浴旋轉蒸發至干，加入30%鹽酸乙醇溶液8 mL，渦旋混勻后備用。

依次用甲醇3 mL、2%甲酸水溶液3 mL，活化MCX固相萃取柱。將備用液過柱。依次用2%甲酸水溶液3 mL、甲醇3 mL淋洗，抽干。用5%氨化甲醇溶液3 mL洗脫。洗脫液于50℃水浴下用氮氣吹干。用流動相1.0 mL(0.02 mol/L乙酸銨溶液∶乙腈=85∶15)溶解，混勻。過濾膜后作為試料溶液，供高效液相色譜分析。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的選擇 參考國內外有關資料，并對氟苯達唑、2－氨基氟苯達唑、噻苯達唑和5－羥基噻苯達唑進行紫外掃描，考慮要同時檢測四種藥物，最終確立其檢測波長為306 nm。

2.2 標準曲線及線性范圍 準確量取適量氟苯達唑、2－氨基氟苯達唑、噻苯達唑、5－羥基噻苯達唑標準工作液，用流動相稀釋成濃度分別為0.02、0.04、0.1、0.2、0.3、0.6、1.5 μg/mL 的系列混合標準溶液，將此系列混合標準溶液，依次從低濃度到高濃度按液相色譜條件進行分析，每一濃度進樣三次，按其所得三次峰面積的平均值與對應的對照溶液的質量濃度做標準曲線，并計算回歸方程及相關系數(表2)。

表2 氟苯達唑、2－氨基氟苯達唑、噻苯達唑和5－羥基噻苯達唑標準曲線

2.3 樣品提取 國內外關于測定羊、雞組織中氟苯達唑、2－氨基氟苯達唑、噻苯達唑和5－羥基噻苯達唑藥物殘留的報道，有液相色譜－串聯質譜、高效液相色譜、熒光檢測及紫外檢測等方法，但檢測波長均有不同。藥物殘留提取方法的手段也均不相同，有液－液提取、液－固提取等。參考國內外的文獻，實驗最初采用液 －固提取的方法，使用 C18、HLB、MAX、MCX、硅膠等固相萃取柱，采用的提取液有不同濃度的無機鹽溶液及直接用有機溶液提取，經過多次試驗反復摸索，最終采用液－固提取，用乙腈作為提取液，從羊、雞組織中提取藥物殘留。

在方法研究過程中，分別用甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯等有機溶劑作為提取液，再加入少量的酸、堿溶液，以便更有利于藥物殘留的提取。經過試驗摸索用乙腈提取，其回收率較為理想。

在提取實驗中，分別在提取液中加入少量的酸、堿溶液。其結果是加入少量的堿溶液比加酸溶液，其效果更為明顯。在兩次提取時均要加堿，如果僅加一次堿，其回收率明顯降低。經過多次試驗反復摸索，在用乙腈作為提取液的同時，加入0.5 mL的碳酸鈉溶液，提高了提取效率。同時對1%、2%、3%、5%四種不同濃度的碳酸鈉溶液進行了考察，實驗結果顯示，加入2%碳酸鈉溶液時提取效率是最高的。因此，最終確立加入碳酸鈉溶液的濃度是2%。

在提取脫脂過程中，分別用異辛烷、正己烷等作為脫脂溶劑進行了試驗，實驗結果顯示用異辛烷明顯要好于正己烷，因此選用異辛烷作為脫脂溶劑。

通過上述樣品提取方法和色譜條件，空白溶液、標準溶液和試樣溶液的高效液相色譜圖分別如圖1、圖2、圖3所示。

2.4 方法準確度和精密度 采用標準添加法，選取3種不同濃度，藥物在羊肝、腎、肌肉、脂肪四種組織的最高殘留限量均為100 μg/kg，選取的三種濃度為20、100、200 μg/kg。藥物在雞肌肉中的最高殘留限量為 200 μg/kg，選取的三種濃度為 20、200、400 μg/kg。藥物在雞肝臟中的最高殘留限量為500 μg/kg，選取的三種濃度為 20、500、800 μg/kg。選取的三種濃度基本包含了上述藥物進行殘留檢測的要求，其中靈敏度為20 μg/kg的濃度點為定量限。每種濃度5個樣品，重復3批次，求回收率，批內、批間變異系數。測定結果如表3～表6所示。

表3 羊腎、羊肝中氟苯達唑、2－氨基氟苯達唑、噻苯達唑和5－羥基噻苯達唑回收率測定結果

(續表)

表4 羊肉、羊脂肪中氟苯達唑、2－氨基氟苯達唑、噻苯達唑和5－羥基噻苯達唑回收率測定結果

(續表)

從上述表中數據可以看出，無論是各種添加濃度的回收率，還是批內、批間的變異系數均符合農業部農發［2003］1號關于發布《獸藥殘留試驗技術規范(試行)》通知中規定的要求。此方法提取過程簡單，操作步驟少，所用化學試劑的量也少，減少了對環境的污染。此方法適用于羊、雞組織中上述藥物殘留的檢測。

表6 雞肝中氟苯達唑、2－氨基氟苯達唑、噻苯達唑和5－羥基噻苯達唑回收率測定結果

［1］陳杖榴.獸醫藥理學［M］.第2版.北京:中國農業出版社，2002:282.