miRNA:急性心肌梗死治療新戰略標靶

王 虹 林英忠 (廣西壯族自治區人民醫院心內科，廣西 南寧 530021)

微小RNA(MircroRNA，miRNA)是由21～23個核苷酸組成的內源性非編碼單股小RNA，通過與目標信使RNA(messenger RNA，mRNA)的3'-非翻譯端(3'-UTR)整合使其翻譯減少或降解，從而調控基因的表達〔1〕，進而調控眾多的生理和病理生理過程，是基因表達的重要調節器。最先確認的miRNA是控制線蟲發育關鍵步驟的lin-4和let-7，隨后的研究在包括人類、果蠅、植物等多種生物物種中通過分子克隆和生物信息學鑒別出數百個 miRNA〔2〕。

在許多疾病的發生過程中miRNA都發揮重要作用，對心血管疾病發病機制的作用正逐漸被闡明。急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)過程中的梗死缺血損傷是因血栓或冠狀動脈粥樣硬化斑塊急性改變引發冠脈血流供應嚴重受損，導致心肌缺血損傷。探討細胞對缺氧反應中特定miRNA的作用，探討特定miRNA在AMI的細胞凋亡、纖維化、新生血管生成以及心率失常中的調控作用，不僅具有理論價值，在臨床上更具有尋求AMI生物標記指標，用于診斷或評估AMI危險度，提高AMI高危病人篩選的敏感性與準確性以及針對特定miRNA進行干預治療的臨床實際應用價值。

1 miRNA及細胞對缺氧的反應及特定miRNA的調控作用

缺氧不僅發生在急性和慢性缺血后，并且在嚴重的病理生理環境中，如快速的組織生長，器官的發育或腫瘤的發生，高海拔狀態時均會發生。氧濃度的降低會引發強烈的反應以緩解組織缺氧及細胞的不可逆性損傷。這一系列的反應包括:內皮細胞增殖、遷徙及成血管化，亦包括生長停止及細胞凋亡。其自然過程的結果取決于多種因素，如細胞來源及基因型，以及缺氧的嚴重程度。而且缺氧是構成腫瘤微環境的主要因素。如果腫瘤處于極度缺氧狀態說明其預后極差而且對傳統治療方法有抵抗。

在缺氧時，有一系列的細胞通路及器官水平的通路被激活以恢復供氧的平衡穩定。缺氧誘發因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α(HIF-1α))無論在正常情況，還是持續缺氧狀態，都通過調節兩個重要的血管形成因子(內皮細胞生長因子及促血管生成蛋白因子-2)起到關鍵的激發新生血管形成的作用〔3〕。

在HIF-1α調節的眾多基因中，miR-210被認為是在缺氧反應中起到最關鍵性作用的miRNA。因為在缺氧的所有細胞、組織中發現其表達升高，miRNA-210是缺氧調控唯一的所有研究均公認的miRNA〔4〕，且不受生長因子缺乏、酸中毒、過氧化的影響。研究認為 HIF-1α誘發 miR-210表達增多，故認為其是miRNA-210的最主要的調控物〔4〕。如果抑制了 HIF-1α，就可以抑制在缺氧狀態下miRNA-210的產生，但如果只是抑制了HIF的主要成分HIF-2α，就無類似的作用。研究發現miRNA-210 的主要靶點是 EFNA3、E2F3、NPTX1、RAD52、ACVR1B、MNT和CASP8AP2等。提示miRNA-210參與調節細胞周期、分化、DNA修復和凋亡〔4〕。在動物實驗中發現，大鼠腦短暫性局灶性缺血模型、小鼠下肢缺血模型、小鼠心衰或者心肌肥大模型中，miRNA-210表達是上調的。臨床試驗發現，在先兆子癇的病人中，其表達亦是上調的。

2 AMI中特定miRNA調控作用

AMI在20～30 min內其不可逆性損傷即開始，一般在嚴重的缺血發生后4～6 h內發生完全的梗死。由于缺氧、線粒體氧化磷酸化的迅速終止導致能量代謝的主要來源ATP的不足。確定的AMI有明確的梗死中心區帶和周邊區帶，缺血區域從中心到周邊損傷嚴重程度的變化，反映了再灌注缺乏程度。AMI在四個方面受特定miRNA調控。

2.1 梗死后細胞的存活 肌肉特異性miRNA-1與心肌細胞及其他細胞系統的凋亡有關。近年發現miRNA-1表達增加與缺血-灌注損傷及心肌梗死AMI后缺血凋亡細胞死亡有關。其是通過轉錄后抑制抗凋亡的蛋白B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)及胰島素樣生長因子-1(IGF-1)導致心肌缺血后凋亡細胞的死亡的〔5〕。

相反地，miRNA-320在缺血-灌注的心臟中無論是體內或體外實驗，其表達均明顯減少〔6〕。與野生型小鼠比較，miRNA-320過表達的轉基因小鼠其梗死和凋亡區域增大，而抗miRNA-320治療可以減小梗死面積，其促進凋亡的作用是直接抑制心臟保護性蛋白-熱休克相關蛋白20(Hsp20)。

Dong等〔7〕發現miRNA-21在心梗后大鼠的心臟中起到保護作用，抑制凋亡。在AMI早期，梗死區miRNA-21是顯著下調，而在邊緣區其表達增加。其機理可能與調控程序性細胞死亡分子(PDCD)-4及激活蛋白(AP)-1有關，其體內實驗證實miRNA-21的過表達可以減少梗死后心臟細胞的凋亡。但是miRNA-21在心臟生物學上其作用非常復雜和多樣性，其亦參與了心臟重構和缺血預適應中抑制促凋亡基因的功能。

2.2 AMI與心律失常 miRNA-1與AMI后心律失常有關，其靶點為間隙連接蛋白43及鉀離子通道亞基Kir2.1〔8〕。其上調是受到β-腎上腺素受體-cAMP-蛋白激酶A信號通路調控，β-受體阻滯劑能夠部分下調miRNA-1靶點KCNJ2和GJA1的表達〔9〕。

2.3 AMI后纖維化和心臟重構 Roy等發現miRNA-21在缺血-灌注損傷心臟區域中特異性地存在，其與心肌纖維化、心臟重構有關。同源重失性磷酸張力蛋白基因(PTEN)是miRNA-21的靶點〔10〕。在心肌缺血-灌注后，心肌纖維母細胞中的miRNA-21產生抑制PTEN繼而是基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)產生增加，導致心臟重構。Rooij等〔11〕發現左冠脈堵塞后，在梗死的邊緣區心肌纖維母細胞中miRNA-29b表達下調。

2.4 梗死后新生血管生成 Bonauer等〔12〕發現在體外試驗中發現miRNA-92a是內皮細胞內源性的血管形成的抑制物，在心肌缺血或肢端缺血的小鼠動物模型中其抑制血管形成的作用更明顯。抑制miRNA-92a的表達可以改善左室功能、減少梗死面積、減少凋亡細胞數及增加血管數。

3 miRNA在AMI臨床應用展望

AMI過程中對缺血起關鍵調節作用的特定miRNA的確定，為AMI臨床診斷治療開辟了新途徑。特定miRNA可以發展作為AMI良好的相對無創性生物標記指標;特定miRNA可以發展作為AMI臨床新治療戰略靶標。

3.1 miRNA作為診斷或預測的生物標記指標 疾病診斷或預測的生物標記物測定樣品的采集必須是無創性的，這是一條重要的原則。miRNA一直是從血清、血漿或其他體液中取樣測定。腫瘤研究表明，幾百個miRNA構成的miRNA圖譜比幾千個mRNA構成的mRNA圖譜對癌癥分類更有效，特別是在組織病理無法分類時〔13〕。對于確定腫瘤病人對化療的反應和存活，miRNA有預測意義〔14〕。miRNA在心血管疾病中潛在的診斷、預測價值，僅僅剛剛開始研究，但至今所獲得的結果顯示，這種作用價值不只是僅存在于腫瘤的診斷、預測。去甲腎上腺素誘發的大鼠心肌損傷模型，心臟特定miRNA-208血漿中的聚集度增高，并與典型的心肌損傷生物標記物——肌鈣蛋白I的含量相關〔15〕。前述特定miRNA與AMI的研究資料提示，有理由相信通過進一步深入研究應能發現用于診斷和預測AMI，高危人群的特定miRNA生物標記指標。

3.2 miRNA作為AMI臨床新治療戰略靶標 特定miRNA作為AMI臨床治療新戰略靶標，至少有二個理由可以認為有突破。一是單一的miRNA可以調節多個靶基因并能夠影響到整個基因網絡;二是特定miRNA無論是體外還是體內，都能被有效抑制。特定miRNA還能借助某些工具定向地降低致病的或異常表達的miRNA水平，或增高具有有益功能的特定miRNA水平。由于多種核酸酶以及磷酸二酯酶能迅速降解核酸，已經開發出多種增強寡核苷酸穩定性的化學修飾方法用于調控miRNA〔16〕。

特定miRNA作為AMI臨床新治療戰略靶標的可行性，已經被一個miRNA拮抗劑臨床應用證實認可。這標志miRNA抑制劑可能成為一種重要的新藥。該臨床試驗(19)是以肝臟特定miRNA-122作為C型肝炎的治療靶標，開發應用基于鎖核苷酸(LNA)的 miRNA拮抗劑調控miRNA-122，獲得成功。由于miRNA-122還調控血膽固醇水平，所以這種新開發的miRNA拮抗劑也可能在心血管領域有重要的應用價值〔17〕。

3.2.1 miRNA上調 合成分子結構與干擾RNA相似的短雙股寡核苷酸，可以實現miRNA的過表達，雙股結構對于有效識別并定位加載到RNA誘導的沉默復合體(RISC)是必須的。合成的短雙股寡核苷酸中的一股是成熟的miRNA，另一股與其互補，只有成熟miRNA進入并與RISC結合。盡管這一技術在體外試驗被成功使用，但至今還沒有證實在體內應用成功。

應用表達載體可以實現miRNA的持續表達。這種方法已被成功地用于增加miRNA-155表達，治療白血病、乳腺癌、胃癌的體內試驗〔18〕;還被用于證實miRNA-15a、miRNA-16在前列腺癌中起抑腫瘤基因的作用〔18〕。過表達方法有內生性miRNA過飽和進而導致內生性miRNA失調節危險。腺相關病毒所致shRNA強烈的過表達，誘發肝源性miRNA下調，肝損傷以及試驗小鼠死亡〔19〕。

3.2.2 miRNA拮抗劑 miRNA拮抗劑是與目的miRNA完全互補的單股寡核苷酸，有抑制miRNA的作用。miRNA拮抗劑捆綁在成熟miRNA上，起競爭抑制作用，使特定miRNA進入RISC減少。miRNA拮抗劑也可以捆綁在miRNA前體上，阻止其進一步加工，即抑制其進入RISC或抑制其由細胞核進入細胞質。采用靜脈注射經過修飾的miRNA拮抗劑全身給藥方式，結果包括心臟在內的多組織，相應 miRNA表達顯著降低〔20〕。用經修飾的反義RNA處理小鼠，顯示miRNA-133在控制心肌肥厚〔21〕、miRNA-29 在心肌纖維化中起重要作用〔22〕。

3.2.3 miRNA海綿，miRNA橡皮擦(eraser)和miRNA面紗(mask)miRNA海綿，miRNA橡皮擦和miRNA面紗是三種不同的miRNA拮抗劑。miRNA海綿含有多個反義寡核苷酸，為防止RNA干擾切割，在通常RISC切割部位設計有凸起。miRNA橡皮擦由二個完全互補的反義寡核苷酸構成。miRNA面紗是捆綁在mRNA的miRNA目標序列上的寡核苷酸。miRNA海綿已成功在體內用于miRNA-31下調〔23〕。miRNA橡皮擦被用于證實miRNA-21的靶點是 Sprouty2〔24〕。每個miRNA可以調節數百個mRNA〔24〕，直接抑制miRNA可能影響許多下游靶基因。miRNA面紗用于抑制miRNA/mRNA關聯。

3.3 運載系統 miRNA治療的成功有賴于反義寡核苷酸或表達載體、合成的短雙股寡核苷酸有效地被運載到達靶標。盡管全身給藥技術有了顯著的進步，但是已開發的多數核酸載體至今只證實運載到肝臟是有效的。基于RNA干預的基因治療已經使用了數年，miRNA作為治療靶標，需要評定載體運載核酸到達組織和細胞的能力。寡核苷酸為了穿過目的細胞的脂質雙層膜，需要包裹在脂質體或納米粒子中〔25〕。最近開發出了一種新型的脂質體(“lipidoids”)，無論其運載雙股小干擾，還是單股寡核苷酸，都顯示高水平的特定內生基因轉錄沉默〔26〕。lipidoids的初步動物(小鼠、大鼠和非人靈長類)模型試驗符合安全和具體標準。

納米技術提供了一個誘人的藥物運載系統，與其他載體比較，納米載體有相同的運載能力，而極少毒性。納米載體已成功地應用于體外和體內，特定地殺死癌細胞而不損害健康細胞〔27〕。寡核苷酸與脂質分子，如高密度脂蛋白結合，能更好地被運送到特定器官。

病毒已被廣泛用做載體，最近腫瘤基因治療的臨床試驗載體就是病毒。改良腺病毒，如腺相關病毒和慢病毒，與siRNA/shRNA穩定結合并成功將其運送到達靶基因〔28〕。

miRNA抑制劑已成功用于小鼠并可能用于基于miRNA的治療。在心血管領域，對miRNA的興趣正在增長。研究miRNA的表達和功能，將增加對被AMI激活的分子機制以及AMI后退行性變和再生過程的調控的了解。以miRNA為靶標的AMI治療新戰略，面臨的挑戰包括運載系統的效率，以及其選擇特定靶器官和在同一器官中選擇不同細胞類型的能力。此外心臟的成纖維細胞和心肌細胞對于miRNA治療，可能會產生與其他器官完全不同的功能結果。隨著研究的深入，這些問題將會得以解決。新的AMI診斷、預測指標及治療戰略將會產生。

1 Bartel DP.MicroRNAs:genomics，biogenesis，mechanism，and function〔J〕.Cell，2004;116(2):281-97.

2 Ozsolak F，Poling LL，Wang Z，et al.Chromatin structure analyses identify miRNA promoters〔J〕.Genes Dev，2008;22(22):3172-83.

3 Pouysségur J，Dayan F，Mazure NM.Hypoxia signalling in cancer and approaches to enforce tumour regression〔J〕.Nature，2006;441(7092):437-43.

4 Crosby ME，Kulshreshtha R，Ivan M，et al.MicroRNA regulation of DNA repair gene expression in hypoxic stress〔J〕.Cancer Res，2009;69(3):1221-9.

5 Tang Y，Zheng J，Sun Y，et al.MicroRNA-1 regulates cardiomyocyte apoptosis by targeting Bcl-2〔J〕.Int Heart J，2009;50(3):377-87.

6 Ren XP，Wu J，Wang X，et al.MicroRNA-320 is involved in the regulation of cardiac ischemia/reperfusion injury by targeting heat-shock protein 20〔J〕.Circulation，2009;119(17):2357-66.

7 Dong S，Cheng Y，Yang J，et al.MicroRNA expression signature and the role of microRNA-21 in the early phase of acute myocardial infarction〔J〕.J Biol Chem，2009;284(43):29514-25.

8 Zhao Y，Ransom JF，Li A，et al.Dysregulation of cardiogenesis，cardiac conduction，and cell cycle in mice lacking miRNA-1-2〔J〕.Cell，2007;129(2):303-17.

9 Lu Y，Zhang Y，Shan H，et al.MicroRNA-1 downregulation by propranolol in a rat model of myocardial infarction:a new mechanism for ischaemic cardioprotection〔J〕.Cardiovasc Res，2009;84(3):434-41.

10 Roy S，Khanna S，Hussain SR，et al.MicroRNA expression in response to murine myocardial infarction:miR-21 regulates fibroblast metalloprotease-2 via phosphatase and tensin homologue〔J〕.Cardiovasc Res，2009;82(1):21-9.

11 Van Rooij E，Sutherland LB，Qi X，et al.Control of stress-dependent cardiac growth and gene expression by a microRNA〔J〕.Science，2007;316(5824):575-9.

12 Bonauer A，Carmona G，Iwasaki M，et al.MicroRNA-92a controls angiogenesis and functional recovery of ischemic tissues in mice〔J〕.Science，2009;324(5935):1710-3.

13 Lu J，Getz G，Miska EA，et al.MicroRNA expression profiles classify human cancers〔J〕.Nature，2005;435(7043):834-8.

14 Akamizawa J，Konishi H，Yanagisawa K，et al.Reduced expression of the let-7 microRNAs in human lung cancers in association with shortened postoperative survival〔J〕.Cancer Res，2004;64(11):3753-6.

15 Ji X，Takahashi R，Hiura Y，et al.Plasma miR-208 as a biomarker of myocardial injury〔J〕.Clin Chem，2009;55(11):1944-9.

16 Peek AS，Behlke MA.Design of active small interfering RNAs〔J〕.Curr Opin Mol Ther，2007;9(2):110-8.

17 Krützfeldt J，Rajewsky N，Braich R，et al.Silencing of microRNAs in vivo with'antagomirs'〔J〕.Nature，2005;438(7068):685-9.

18 Bonci D，Coppola V，Musumeci M，et al.The miR-15a-miR-16-1 cluster controls prostate cancer by targeting multiple oncogenic activities〔J〕.Nat Med，2008;14(11):1271-7.

19 Grimm D，Streetz KL，Jopling CL，et al.Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathways〔J〕.Nature，2006;441(7092):537-41.

20 Krützfeldt J，Kuwajima S，Braich R，et al.Specificity，duplex degradation and subcellular localization of antagomirs〔J〕.Nucleic Acids Res，2007;35(9):2885-92.

21 CaréA，Catalucci D，Felicetti F，et al.MicroRNA-133 controls cardiac hypertrophy〔J〕.Nat Med，2007;13(5):613-8.

22 van Rooij E，Sutherland LB，Thatcher JE，et al.Dysregulation of microRNAs after myocardial infarction reveals a role of miR-29 in cardiac fibrosis〔J〕.Proc Natl Acad Sci U SA，2008;105(35):13027-32.

23 Valastyan S，Reinhardt F，Benaich N，et al.A pleiotropically acting microRNA，miR-31，inhibits breast cancer metastasis〔J〕.Cell，2009;137(6):1032-46.

24 Sayed D，Rane S，Lypowy J，et al.MicroRNA-21 targets Sprouty 2 and promotes cellular outgrowths〔J〕.Mol Biol Cell，2008;19(8):3272-82.

25 Fenske DB，Chonn A，Cullis PR.Liposomal nanomedicines:an emerging field〔J〕.Toxicol Pathol，2008;36(1):21-9.

26 Akinc A，Zumbuehl A，Goldberg M，et al.A combinatorial library of lipid-like materials for delivery of RNAi therapeutics〔J〕.Nat Biotechnol，2008;26(5):561-9.

27 Choi Y，Thomas T，Kotlyar A，et al.Synthesis and functional evaluation of DNA-assembled polyamidoamine dendrimer clusters for cancer cellspecific targeting〔J〕.Chem Biol，2005;12(1):35-43.

28 Rubinson DA，Dillon CP，Kwiatkowski AV，et al.A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells，stem cells and transgenic mice by RNA interference〔J〕.Nat Genet，2003;33(3):401-6.