沙門氏菌分子生物學研究進展＊

黃靜瑋,汪銘書,程安春

沙門氏菌分子生物學研究進展＊

黃靜瑋1,2,3,汪銘書1,2,3,程安春1,2,3

自1885年Salmon等分離得到豬霍亂沙門氏菌以來,目前已檢出沙門氏菌血清型2500余種,我國已有292個血清型報道[1]。沙門氏菌是重要的人獸共患病病原菌之一,本文就沙門氏菌基因組學、鞭毛蛋白、外膜蛋白以及毒力島等方面研究進展進行總結,以期為開展相關研究提供參考。

1 基因組特征

研究發現沙門氏菌具有屬特異性基因、血清群特異性基因及血清型特異性基因。屬特異性基因包括 inv、hut、hns、spv、fim、hilA 、16SrDNA 等[2],血清群特異性基因主要為 rfb,血清型特異性基因包括 f liC、f ljB、via等,filC可作為甲型副傷寒沙門氏菌特異性檢測基因[3]。

分析副傷寒沙門氏菌基因組發現,其與鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌等沙門氏菌間約有90%的共同基因,而生物學性狀差異主要由10%左右的基因決定,這10%的基因結構常具有可塑性,可以不同方式重組表現不同功能[4]。與其他沙門氏菌相比,副傷寒沙門氏菌與傷寒沙門氏菌基因具有更高的同源性。丙型副傷寒沙門氏菌RK4594高分辨圖譜,與傷寒沙門氏菌L T2圖譜相似[5]。甲型副傷寒沙門氏菌SPA-2-Sop E與傷寒沙門氏菌Sop E高度相似[6],其差異主要在于前噬菌體和假基因。通過假基因的形成、密碼子替換、突變、基因缺失可導致甲型副傷寒沙門氏菌小序列的多樣性和基因功能改變,從而使其在感染宿主過程中可尋找更適合的靶位置。有報道指出在甲型副傷寒沙門氏菌存在43個特異性蛋白質編碼序列以及多種小片段的隱藏質粒 ,stk F、spa2473、spa2539、hsdM 是其特異性的靶位點[7]。

Hfq與沙門氏菌毒力密切相關,超過30%的非編碼sRNA可與 Hfq蛋白結合,從而影響 RNA的穩定性或通過輔助非編碼sRNA與m RNA結合以調節靶基因表達[8]。Hfq與 RNase結合形成的降解復合體,可同時降解 sRNA和m RNA,以抑制目的基因表達。此外 Hfq還能夠影響多種細菌外毒素表達[9]。

2 外膜蛋白

外膜蛋白可分為主要蛋白:微孔蛋白、脂蛋白、OmpA、OmpB、OmpC、Omp F和微量蛋白。

2.1 編碼外膜蛋白核苷酸的同源性 通過外膜蛋白抗原相似性的高低,可判斷細菌親緣關系的遠近。沙門氏菌外膜蛋白基因表達和抗原性具有較高的相似性,不同地區沙門氏菌DNA往往可以編碼同一種外膜蛋白,但沙門氏菌外膜蛋白編碼基因也可通過后天獲得[10]。外膜蛋白的表達常由sRNA調節,目前已發現8個OM P調節 sRNA:InvR、M icA、M icC、M icF、Om rAB、RseXand、RybB,但具體調節機制尚未明確[11]。與OmpC和Omp F高水平表達相比ompS1、omp S2編碼的孔蛋白僅處于低水平表達狀態。OmpB、OmpC、Omp F、OmpS1、Omp S2 在表達過程中相互作用,并且受LeuO、H-NS、M icC、M icF、hfq、OmpR/EnvZ、Rcs系統等調控[12-13]。在高滲應激條件下hfq與OmpR/EnvZ、Rcs系統存在交叉調節,但具體機制尚未明確。

Omp S1有 3個操縱子:Pl、P2、P3。Pl控制OmpR的起始表達,只有在 Pl存在時OmpR才會表達;當OmpR缺失,P2參與Omp S的低水平表達;P3有微弱的連續的活性,對Omp R表達起輔助作用[14]。OmpS1的基因表達既不受滲透壓誘導,也不受負調控機制中的IHF調節子的影響,與大腸埃希菌 K-12有一定的同源性,均具有開放式閱讀框架。

2.2 外膜蛋白的免疫學特性 副傷寒沙門氏菌外膜蛋白 PagC、Omp X、NmpC、FadL、TolC 和 BtuB等均具有較強的免疫原性,可誘導機體產生強烈而持久的免疫應答,尤其以OmpC介導的體液免疫應答為甚,當外膜蛋白以非共價鍵與肽聚糖緊密結合,形成相對非特異性的通道時具有高度的保守性[12]。

3 鞭毛蛋白

沙門氏菌鞭毛蛋白可引起強烈的免疫應答,是沙門氏菌重要的致病因素,可在不同環境中表達出不同類型。鞭毛蛋白是沙門氏菌鞭毛絲狀部的結構蛋白(即 H抗原),由fliC或fljB編碼[15]。

3.1 分型 H抗原 H抗原可分Ⅰ和Ⅱ相,Ⅰ相特異性高且抗原性存在較大差異,Ⅱ相特異性低且為多種沙門氏菌所共有。H1抗原在沙門氏菌中普遍存在,經測序發現不同血清型沙門氏菌重 H 1鞭毛蛋白決定細菌的結構和功能的兩端的氨基酸序列高度保守,而決定細菌的血清型得中間區高度變異,IV、V I區的同源性分別低于27%、39%。

甲型副傷寒桿菌鞭毛蛋白僅有 I相 H抗原a(H la),H1a與鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白FIiC的核苷酸及氨基酸序列高度相似[16]。甲型副傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白FliC與傷寒桿菌等沙門氏菌鞭毛蛋白具有相同的抗原決定簇,存在明顯的抗原和抗體交叉,可結合 TOLL樣受體-5,常與 CD4+/CD8+T細胞相互作用[17]。甲型副傷寒沙門氏菌 H la、FliC、SpaO蛋白單克隆抗體對實驗感染動物均有明顯保護作用,在自然感染病人血清中也能檢出相應抗體。但通過鞭毛基因 FliC測序以及對 I相鞭毛抗原進行基因血清分型和鑒定發現在分子水平上并不能把 H∶d和 H∶z42以及 H∶g、q和 H∶g、m、q區分開[18]。

3.2屬特異性共同抗原 沙門氏菌鞭毛蛋白上存在屬特異性抗原決定簇,其共同抗原表位是沙門氏菌屬的識別標志,具有高度屬特異性和屬內保守性。屬特異性共同抗原同時存在于 I相及Ⅱ相鞭毛;在屬內同源性較高且廣泛存在,而屬間出現的頻率很低且不受鞭毛位相改變的影響。但不同于O抗原和H分型抗原的分布特征,沙門氏菌鞭毛上可存在多個屬特異性抗原表位。屬特異共同抗原免疫原性較好,但其免疫性比分型 H抗原弱,提示沙門氏菌分型H抗原表位是鞭毛蛋白分子上的優勢表位。

4 毒力島及Ⅲ型分泌系統

4.1 毒力島 沙門菌毒力島(SPI)指與沙門氏菌侵襲力相關的毒力基因及操縱子聚集成簇分布于細菌染色體的某些特定區域,而這些毒力基因在染色體組成相似的大腸埃希菌中并不存在。目前研究最廣泛的是 SPI-1、SPI-2、SPI-3、SPI-4 和 SPI-5,而在傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌中新鑒定出的 SPI-6、SPI-7、SPI-9、SPI-11、SPI-12、SPI-17被陸續報道[6]。各島的各種毒力基因均受dam、pho P/phoQ等調節基因調節,若刪除調節基因,細菌毒力將大大降低[19]。

SPI-1 含 inv、hil、org、spt、spa、sip、iag、iae、prg、sic基因[20-21],編碼包括調節子和分泌性效應蛋白在內 T3SS的各種成分,其效應蛋白與細菌和宿主細胞的粘附有關,可引起腸黏膜細胞上的肌動蛋白發生重排,有利于沙門氏菌的內化。其表達受HilA、HilD、InvF、inv/spa、p rg操縱子和 pp Gpp 調控[22-23],Hfq可在 SPI-1基因表達中擴增[8],并受PL lacO-1啟動子調節[24],是 InvR積聚的關鍵,但其對sRNA編碼區域的毒性尚未明確。InvR由轉錄子 HilD,HilC激活,同時 HilD,HilC可拮抗 HilA作用[25]。

SPI-1編碼的蛋白質可入侵宿主非吞噬細胞,離體誘導巨噬細胞凋亡,在沙門氏菌侵襲巨噬細胞和腸上皮細胞過程中發揮重要作用。

SPI-2的含4個操縱子:ssa編碼 T3SS成分,ssr編碼分泌系統調節子,ssc編碼分子伴侶,sse編碼分泌系統效應蛋白[26]。H-NS是SPI-2分泌的主要蛋白,與A T含量豐富的區域結合,表達主要受IHF、Fis、PhoP、SpiR/SsrB、ydg T/SsrB、hha/SsrB調控[27-29]。SPI-2可控制沙門氏菌在吞噬細胞和上皮細胞內的復制,并使沙門氏菌逃避巨噬細胞輔酶Ⅱ依賴的殺傷作用。

SPI-3含10個開放閱讀框,組成6個轉錄單位,其中mgtCB的產物編碼的M g2+轉運子可介導細菌在巨噬細胞和低M g2+環境中存活[30]。

SPI-4含18個開放閱讀框,但大多表現為SiiA至F6個開放閱讀框,其中SiiE是最主要分泌的蛋白,主要由 I型分泌系統分泌,其調控與 SPI-1相關,編碼介導毒素分泌的I型分泌系統,并參與調節細菌適應巨噬細胞內環境,但具體功能有待研究[31]。

SPI-5含 sop、sig、pip,編碼參與腸粘膜液體分泌和炎癥反應的相關蛋白,并且由 SPI-1和SPI-2編碼的蛋白所調控[32]。

另外在丙型副傷寒沙門氏菌中新鑒定出的SPI-7長 134kb,含 Sop E噬菌體、viaB操縱子、phoN基因、一個臨近 tRNA pheU位點的75kb的片段和一個編碼 IV型鞭毛的區域的鉤端螺旋體。當DNA片段插入基因序列,可改變基因平衡狀態,以優化基因結構,對DNA轉化、活化以及穩定性保護存在一定功能[33]。

4.2 Ⅲ型分泌系統(T3SS) Ⅲ型分泌系統(T3SS)是SPI-1和SPI-2編碼特異性的蛋白分泌和轉運系統,包括至少20種內膜蛋白及外膜蛋白。沙門氏致病的毒力因子由20～50個基因組成的基因簇編碼的 T3SS分泌的蛋白和其靶蛋白組成,這些毒力因子直接或間接刺激細胞轉導信號,引起一系列細胞反應[34]。

T3SS蛋白分子量大多在26～85kDa之間,普遍含外膜蛋白 InvG、PrgH和 Prg K,內膜蛋白 InvA、SpaP、SpaQ、SpaR 和 SpaS,附屬蛋白 SicA、Inv I、IacP、InvH和OrgA。可按功能將其分為兩類:一類發揮蛋白分泌功能,另一類將蛋白轉送到宿主細胞的效應分子,這兩個系統具有很高的同源性,其中InvJ和SpaO是 T3SS必需的特異性蛋白,SipB和SipC是沙門氏菌進入宿主細胞的功能蛋白[35]。電子顯微鏡分析表明,SPI-1編碼的 T3SS是一種在生化和結構上均類似于細菌鞭毛系統的“針狀復合物”,該復合物編碼的 Prg K、PrgH、InvG,、InvA、Prg I、Prg K等,PrgH或InvG的突變可導致細菌入侵非吞噬的上皮細胞所必需的效應蛋白 SipA、SipB、SipC、SipD等分泌受阻[35]。SPI-1分泌的 Sip A、SipC、Sop E、Sop E2和 SopB通過調節宿主肌動蛋白細胞骨架,促使細菌入侵宿主細胞[21]。SPI-2效應蛋白通過調節細菌在細胞內的移動,關系到細菌在宿主細胞內的存活。

T3SS的調控主要受時間和空間的限制,轉錄后調控機制在與宿主細胞相互接觸后發揮其功能,入侵基因表達的調控由轉錄水平的環境因素決定的。目前,在分子水平僅發現DNA的超螺旋結構會影響蛋白的分泌。在蛋白水平 InvF和 HilA參與沙門氏菌的入侵。InvF屬于轉錄激活子A raC家族;HilA屬于轉錄激活子Omp R/ToxR家族,HilA又調節orgA、sipC和invF,它們形成一個調控莖環結構[36]。此外,T3SS還受到調控網的影響,如菌毛調控系統、PhoP/PhoQ[27]調控系統和反應調節蛋白等。

5 展 望

沙門氏菌是目前研究較為廣泛的人獸共患病致病菌之一,但對沙門氏菌的研究主要集中于沙門氏菌屬的相關研究,而對于沙門氏菌單獨的種以及亞種等的特異性研究相對較少。雖然已知沙門氏菌不同種的基因組之間具有較高相似性,但具有種特異性的基因尙不十分明確,因此篩選種特異性基因有利于建立特異性檢測方法,實現對沙門氏菌菌種的快速診斷、流行病學調查以及監測控制。另外,闡明尙不清楚的沙門氏菌外膜蛋白、鞭毛蛋白、SPI、T3SS的基因及蛋白相互調節的機制,對于闡明其分子致病機制、研發新藥及疫苗有著重要指導意義,應該成為今后的重點研究方向之一。

[1]彭海濱.我國沙門菌污染分布概況[J].中國國境衛生檢疫雜志2006,29(2):125-128.

[2]Yoshida C.Methodologies towards the development of an oligonucleotide microarray for determ ination of Salmonella serotypes[J].Journal of Microbiological Methods,2007,70(2):261-271.

[3]A li A.Nested PCR based diagnosis of Salmonella enterica serovar Paratyphi A directly from blood samples[J].Pak J Med Sci July-Sep tember,2008,24(4):545-549.

[4]Holt K.Pseudogene accumulation in the evolutionary historiesof Salmonella enterica serovars Paratyphi A and Typhi[J].BMC Genomics,2009,10(1):36.

[5]Wei-Qiao L.Diverse genome structuresof Salmonella paratyphi C[J].BMC Genomics,2007:8.

[6]Didelot X.A bimodal pattern of relatedness between the Salmonella Paratyphi A and Typhi genomes:Convergence or divergence by homologous recombination[J].Genome Research,2007,17(1):61.

[7]Ou H.Translational genomics to develop a Salmonella enterica serovar Paratyphi A multip lex polymerase chain reaction assay[J].Journal of Molecular Diagnostics,2007,9(5):624.

[8]Sittka A.The RNA chaperone Hfq is essential for the virulence of Salmonella typhimurium[J].Molecular Microbiology,2007,63(1):193.

[9]Papenfort K,Vogel J.M ultip le target regulation by small noncoding RNAs rewires gene expression at the post-transcriptional level[J].Research in Microbiology,2009,160(4):278-287.

[10]Guillier M,Gottesman S,Storz G.Modulating theoutermembrane with small RNAs[J].Genes&Development,2006,20(17):2338.

[11]Mandin P.Identification of new noncoding RNAs in L isteria monocytogenes and p rediction of m RNA targets[J].Nucleic Acids Research,2007,35(3):962.

[12]Hamid N,Jain S.Characterization of an outer membrane protein of Salmonella enterica serovar typhimurium that confers p rotection against Typhoid[J].Clinical and Vaccine Immunology,2008,15(9):1461.

[13]MacRitchie D.Two-component signaling and gram negative envelope stress response systems[M].Bacterial signal transduction:netwo rks and drug targets,2008:80-110.

[14]Oropeza R.Negative and positive regulation of the non-osmoregulated ompS1 porin gene in S.typhi:a novel regulatory mechanism that involves OmpR[J].Mol Microbiol,1999,32:243-252.

[15]Simon R,Samuel C.Activation of NF-[kappa]B-dependent gene expression by Salm onella f lagellins FliC and FljB[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2007,355(1):280-285.

[16]Parkhill J.Complete genome sequenceof amultiple drug resistant Salmonella enterica serovar Typhi CT18[J].Nature,2001,413(6858):848-852.

[17]Oropeza R,Calva E.The cysteine 354 and 277 residuesof Salmonella enterica serovar Typhi EnvZ are determinants of autophosphorylation and OmpR phosphorylation[J].FEMSM icro-biology Letters,2009,292(2):282-290.

[18]Sonne-Hansen J,Jenabian S.Molecular serotyping of Salmonella:Identification of the phase 1 H antigen based on partial sequencing of the fliC gene[J].Apmis,2005,113(5):340-348.

[19]Marcus S.Salmonella pathogenicity islands:big virulence in small packages[J].Microbes and Infection,2000,2(2):145-156.

[20]Virlogeux-Payant I.TolC,but not AcrB,is involved in the invasiveness of multidrug-resistant Salmonella enterica serovar Typhimurium by increasing type III secretion system-1 expression[J].International Journal of Medical Microbiology,2008,298(7-8):561-569.

[21]Lara-Tejero M,Galan J.Salm onella enterica serovar typhimurium pathogenicity island 1-encoded type IIIsecretion system translocasesmediate intimate attachment to nonphagocytic cells[J].Infection and Immunity,2009,77(7):2635.

[22]Pfeiffer V.A small non-coding RNA of the invasion gene island(SPI-1)rep resses outer membrane protein synthesis from the Salmonella core genome[J].Molecular Microbiology,2007,66(5):1174-1191.

[23]Thompson A.The bacterial signal molecule,pp Gpp,mediates the environmental regulation of both the invasion and intracellular virulence gene p rograms of Salmonella[J].Journal of Biological Chemistry,2006,281(40):30112.

[24]U rban J,Vogel J.Translational control and target recognition by Escherichia coli small RNAs in vivo[J].Nucleic Acids Research,2007,35(3):1018-1037.

[25]Ellermeier J,Slauch J.Adaptation to the host environment:regulation of the SPI1 type III secretion system in Salmonella enterica serovar Typhimurium[J].Current Opinion in Microbiology,2007,10(1):24-29.

[26]Coombes B.SseL is a salmonella-specific translocated effector integrated into the SsrB-controlled salmonella pathogenicity island 2 type III secretion system[J].Infection and Immunity,2007,75(2):574.

[27]Kong W,Weatherspoon N,Shi Y.Molecular mechanism for establishment of signal-dependent regulation in the PhoP/PhoQ system[J].Journal of Biological Chemistry,2008,283(24):16612.

[28]Bustamante V.HilD-mediated transcrip tional cross-talk betw een SPI-1 and SPI-2[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2008,105(38):14591.

[29]Silphaduang U.Rep ression of intracellular virulence factors in Salmonella by the Hha and Ydg T nucleoid-associated proteins[J].Journal of Bacteriology,2007,189(9):3669.

[30]Chiu C.The genome sequence of Salmonella enterica serovar Choleraesuis,a highly invasive and resistant zoonotic pathogen[J].Nucleic Acids Research,2005,33(5):1690.

[31]Gerlach R.Salmonella pathogenicity island 4 encodes a giant non-fimbrial adhesin and the cognate type 1 secretion system[J].Cellular Microbiology,2007,9(7):1834-1850.

[32]Knodler L.Salmonella effectors within a single pathogenicity island are differentially expressed and translocated by separate type III secretion systems[J].Molecular Microbiology,2002,43(5):1089-1103.

[33]Liu G.Genome plasticity and ori-ter rebalancing in Salmonella typhi[J].Molecular Biology and Evolution,2006,23(2):365.

[34]Schlumberger M,Hardt W.Salmonella type III secretion effectors:pulling the host cell’s strings[J].Current Opinion in Microbiology,2006,9(1):46-54.

[35]Galkin VE,Schmied WH,Schraidt O,et al.The Structure of the Salmonella typhimurium type III secretion System need le show s divergence from the flagellar system[J].Journal of Molecular Biology,2010,396(5):1392-1397.

[36]Main-Hester K.Coordinate regulation of Salmonella pathogenicity island 1(SPI1)and SPI4 in Salmonella enterica serovar Typhimurium[J].Infection and Immunity,2008,76(3):1024.

1002-2694(2011)07-0649-04

R378.2

A

＊教育部“長江學者和創新團隊發展計劃”創新團隊項目(IRT0848)

程安春,Email:chenganchun@vip.163.com

1.四川農業大學動物醫學院禽病防治研究中心,雅安625014;2.四川農業大學動物疫病與人類健康四川省重點實驗室,雅安 625014;3.四川農業大學預防獸醫研究所

2010-11-06;

2011-04-25