帕金森病模型大鼠內側前額葉皮層中間神經元電活動的增強

王 爽 高 捷 蘇興利 郭玉芳 霍 健 王 湘

(西安醫學院病理生理學教研室，陜西 西安 710021)

哺乳動物腦干上行的單胺能神經系統支配內側前額葉皮層(mPFC)并執行許多重要的大腦高級功能。神經解剖學證實腹側被蓋區(VTA)發出的DA能神經纖維可以支配mPFC中γ-氨基丁酸(GABA)能中間神經元的活動〔1〕。另外，mPFC還接受來源于中腦縫核(DRN和MRN)的5-羥色胺(5-HT)神經纖維支配，而且，5-HT系統對于mPFC中神經元的活動起重要的調節作用〔2〕。黑質紋狀體通路的變性能夠導致5-HT受體表達的異常，同樣在慢性帕金森綜合征的紋狀體、海馬和縫核中5-HT的含量顯著降低〔3〕。這些變化均有可能導致mPFC中GABA能神經元性質的改變。但是，PD情況下，mPFC中GABA能神經元的電活動如何變化并不清楚。因此，本文將以PD模型大鼠為研究對象，采用神經電生理學方法，研究在PD狀態下大鼠mPFC中GABA能中間神經元的電活動改變。

1 材料與方法

1.1 動物和藥品 雄性SD大鼠25只，體重250～320 g，由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供。大鼠在標準環境飼養，室溫20℃ ～25℃，24 h晝夜循環光照，自由攝食飲水。大鼠隨機分為2組:假手術組(n=9)和PD組(n=16)。實驗所用6-羥基多巴胺(6-OHDA)購自美國Sigma公司。

1.2 電生理學記錄和放電形式的分析 電生理學記錄在SNc損毀術后第3周進行。大鼠在4%水合氯醛(400 mg/kg，i.p.)麻醉下行氣管及靜脈插管術后，頭部固定于立體定位儀上，根據Paxinos-Watson大鼠腦定位圖譜，確定右側mPFC的坐標位置:AP:2.7～3.2 mm;L:0.1～0.6 mm;D:1.5～2.5 mm。在冠狀面與中線成2°角處傾斜進針，以避免損傷矢狀竇。采用玻璃微電極細胞外記錄法記錄中間神經元的放電，電極尖端直徑1～2μm，阻抗10～20 MΩ，充灌液為0.5 mol/L醋酸鈉含2%滂胺天藍。細胞放電經MEZ-8301微電極放大器，顯示于VC-11記憶示波器，以觀察電位波形、頻率和細胞放電的形式，同時信號輸入監聽器監聽。將信噪比大于3∶1的、穩定的單細胞放電經生物電信號采集與分析系統(CED1401 Spike2)輸入計算機后，作實時觀察、儲存和進行頻率及放電形式的分析。采樣時間10～20 min。整個實驗過程中監測大鼠的心電，直腸溫度維持在(37±0.5)℃。電生理記錄完畢后，通過玻璃微電極電泳滂胺天藍，標記最后一個記錄位點(－20μA，15 min)。大鼠深度麻醉后，經左心室灌注生理鹽水150 ml，隨后用40 g/L多聚甲醛150 ml灌注固定。取腦后固定4 h，再置于200 g/L蔗糖溶液中過夜，行連續冠狀冰凍切片，片厚40μm，進行尼氏染色，以確定記錄點位置。觀察假手術組大鼠的13個中間神經元和模型組大鼠的34個中間神經元的電活動的變化。

1.3 統計學處理 用SPSS 13.0統計軟件進行分析，實驗結果以x±s表示，組間神經元放電頻率和放電形式參數的比較采用t檢驗;各類放電形式的比例的差異分別采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 兩組大鼠電生理學分析 假手術組大鼠GABA能中間神經元放電頻率為(11.95±0.81)Hz(n=13，放電范圍:1.61～24.57 Hz)，變異系數0.45±0.03。6-OHDA毀損組大鼠GABA能中間神經元放電頻率為(7.28±0.78)Hz(n=34，放電范圍:2.36～31.2 Hz)，與假手術組相比顯著降低(P＜0.001)，變異系數為0.82±0.06，與對照組相比顯著增高(P＜0.001)。

2.2 兩組大鼠放電形式分析 假手術組大鼠GABA能中間神經元呈現三種不同的放電形式，規則放電的比例為40%，不規則放電為43.6%，爆發式放電為16.4%。6-OHDA損毀組大鼠放電形式明顯趨向爆發式活動，與假手術組大鼠相比，6-OHDA毀損組大鼠規則放電的比例為11.5%，不規則放電為45.3%，爆發式放電為43.2%，爆發式放電顯著增多(P＜0.01)。

3 討論

實驗中所討論的神經元均位于mPFC內，其電活動的特征符合GABA能中間神經元的鑒定標準，屬于GABA能中間神經元。本實驗觀察到用6-OHDA損毀大鼠單側SNc后，mPFC的GABA能中間神經元的放電頻率明顯降低，爆發式放電明顯增多;mPFC中GABA能中間神經元頻率降低、爆發式放電活動增強可能和以下原因有關:(1)mPFC接受腦VTA的DA神經纖維傳入，并且表達D1和D2受體〔4〕。D1和D2受體不僅在錐體神經元上有表達，在GABA能中間神經元也有表達。電、化學刺激VTA可以興奮mPFC中GABA能中間神經元電活動〔5〕。而且，當微電泳DA時，也可以興奮mPFC中GABA能中間神經元電活動〔6〕。這種興奮作用可能是直接通過突觸后D1和D2受體使GABA中間神經元興奮。有實驗證明系統給予D1受體激動劑可以使GABA中間神經元活動增強，還有實驗證明D2受體激動劑可以增加mPFC中細胞外GABA的含量〔7〕。有實驗可以證明6-OHDA損毀SNc后VTA中的DA神經元減少了40%左右〔8〕。而且，6-OHDA單側損毀內側前腦束可以明顯減少mPFC中 D1和 D2受體表達。從這些實驗可以看出，6-OHDA損毀SNc能導致VTA的DA神經元的變性和mPFC中GABA能中間神經元上DA受體表達的減少。(2)mPFC也接受DRN和MRN的5-HT神經投射。有實驗表明mPFC中GABA能中間神經元表達5-HT2A受體。近期有實驗證明GABA能神經元也表達5-HT2C受體。5-HT可以通過5-HT2A受體和5-HT2C受體增加mPFC中GABA細胞外含量。神經化學研究發現在PD患者基底神經節、皮層和腦脊液中5-HT和5-HT的代謝產物5-羥乙哚乙酸顯著降低，特別是在具有抑郁的患者〔9〕。腦內5-HT含量的減少是由于SNc DA能神經元的變性引起了中腦縫核5-HT能神經元的減少所致，這一推測也得到神經病理學研究的證實，因為PD患者尸檢發現在縫核50%以上的5-HT能神經元丟失〔10〕。以上兩方面的原因可能是PD模型大鼠GABA能中間神經元頻率降低的主要原因。另外，GABA能中間神經元具有非常廣泛的分支，爆發式放電活動對GABA能中間神經元具有非常重要的意義，因為這可以增加動作電位到達神經末梢區域的可能性，從而增加該區域中GABA的釋放。因此，爆發式放電增多可能是一種代償作用。

1 Onlaor S，Winstein CJ.Function of the'direct'and'indirect'pathways of the basal ganglia motor loop:evidence from reciprocal aiming movements in Parkinson's disease〔J〕.Brain Res Cogn Brain Res，2001;10(3):329-32.

2 De Felipe J，Arellano JI，Gomez A，et al.Pyramidal cell axons show a local specialization for GABA and 5-HT inputs in monkey and human cerebral cortex〔J〕.J Comp Neurol，2001;433(1):148-55.

3 Haddjeri N，Lucas G，Blier P.Role of cholinergic and GABAergic systems in the feedback inhibition of dorsal raphe 5-HT neurons〔J〕.Neuroreport，2000;11(5):3397-401.

4 Guiard BP，El Mansari M，Merali Z，et al.Functional interactions between dopamine，serotonin and norepinephrine neurons:an in vivo electrophysiological study in rats with monoaminergic lesions〔J〕.Int J Neuropsychopharmacol，2008;11(5):625-39.

5 Wang J，O'Donnell P.D1 dopamine receptors potentiate Nmda-mediated excitability increase in layer V prefrontal cortical pyramidal neurons〔J〕.Cereb Cortex，2001;11(5):452-62.

6 Tseng KY，Mallet N，Toreson K，et al.Excitatory response of prefrontal cortical fast-spiking interneurons to ventral tegmental area stimulation in vivo〔J〕.Synapse，2006;59(7):412-7.

7 Lewis BL，O'Donnell P.Ventral tegmental area afferents to the prefrontal cortex maintain membrane potential“up”states in pyramidal neurons via D1 dopamine receptors〔J〕.Cereb Cortex，2000;10(12):1168-75.

8 Wang S，Zhang QJ，Liu J，et al.The firing activity of pyramidal neurons in medial prefrontal cortex and their response to 5-HT1A receptor stimulation in a rat model of parkinson's disease〔J〕.Neuroscience，2009;162(4):1091-100.

9 Santana N，Bortolozzi A，Serrats J，et al.Expression of serotonin-1A and serotonin-2A receptors in pyramidal and GABAergic neurons of the rat prefrontal cortex〔J〕.Cereb Cortex，2004;14(10):1100-9.

10 Winter C，von Rumohrb A，Mundta A，et al.Lesions of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta and in the ventral tegmental area enhance depressive-like behavior in rats〔J〕.Behav Brain Res，2007;184(2):133-41.