格林-巴利綜合征腦脊液蛋白質(zhì)組學(xué)的研究進展

金 濤 孫 莉 張 穎 (吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長春 130021)

格林-巴利綜合征(Guillain-Barre Syndrome，GBS)是一種急性炎癥性自身免疫性周圍神經(jīng)病，以周圍神經(jīng)和神經(jīng)根脫髓鞘、軸索變性及小血管周圍淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤所致的炎性反應(yīng)為主要病理特點。目前，GBS的病因及發(fā)病機制尚未完全闡明，臨床上也缺乏特異有效的治療手段，但鑒于大多認(rèn)為本病是由細(xì)胞免疫和體液免疫共同介導(dǎo)的一種自身免疫性疾病，故采取有針對性的免疫治療可通過抑制自身免疫反應(yīng)，減輕神經(jīng)損害、促進神經(jīng)再生〔1〕。糖皮質(zhì)激素具有抗炎及免疫抑制作用，在GBS的治療中曾廣泛使用;但資料顯示常規(guī)激素治療并不能阻止GBS病情發(fā)展及縮短病程，而且會增加激素治療引起諸多副作用的風(fēng)險，故現(xiàn)已不推薦用于GBS的治療〔2〕。血漿置換(plasma exchange，PE)是最早證實對GBS有效的免疫治療，可去除患者血漿中的抗體、免疫復(fù)合物、炎性介質(zhì)等致病物質(zhì)，從而減輕對周圍神經(jīng)的損傷，達(dá)到延緩GBS病情進展及縮短病程的作用〔3〕;但是，PE治療需要特殊設(shè)備，技術(shù)要求高，且為有創(chuàng)治療，臨床應(yīng)用受到很大限制。靜脈注射免疫球蛋白(IVIG)療法，由于其免疫替代及免疫調(diào)節(jié)的雙重作用，能夠增強機體的抗感染能力，明顯有利于神經(jīng)功能的恢復(fù)〔4〕，但是，IVIG價格昂貴，而且存在血制品應(yīng)用的一系列風(fēng)險。總之，目前以GBS發(fā)病機制為依據(jù)所進行的免疫治療，療效尚不夠穩(wěn)定，個體差異懸殊，預(yù)后也很難估計，使GBS的醫(yī)療救治工作面臨很大的困難。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)簡介

近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展日新月異，正越來越廣泛的應(yīng)用于科學(xué)研究及臨床工作中。廣義上講，蛋白質(zhì)組(Proteome)是指“一種細(xì)胞、組織、體液或完整的生物體所擁有的全套蛋白質(zhì)”〔5〕。蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)則是以蛋白質(zhì)組為研究對象，大規(guī)模、有系統(tǒng)地研究蛋白質(zhì)的特征及結(jié)構(gòu)，包括蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、氨基酸序列、翻譯后修飾及蛋白質(zhì)間的相互作用等，從而在蛋白質(zhì)水平上研究生物體的各種生理生化過程以及疾病的病理過程〔6〕。目前蛋白質(zhì)組學(xué)的基本技術(shù)是利用雙向電泳(two-dimensional electrophoresis，2-DE)對全部蛋白質(zhì)進行分離，然后通過質(zhì)譜等技術(shù)對蛋白點進行鑒定。運用蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)，比較病變組織(細(xì)胞或體液)與其起源的正常組織(細(xì)胞或體液)或疾病發(fā)展不同階段組織中蛋白質(zhì)在表達(dá)數(shù)量、表達(dá)水平和修飾狀態(tài)上的差異，可以發(fā)現(xiàn)與病變相關(guān)的特異蛋白質(zhì)，它們不僅可為研究疾病發(fā)病機制提供線索，而且可作為疾病診斷和治療的生物標(biāo)志物〔7〕。

2 腦脊液(CSF)蛋白質(zhì)組學(xué)的特性

在神經(jīng)科學(xué)方面，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究已廣泛應(yīng)用于腦組織及細(xì)胞培養(yǎng)中，但是，有關(guān)CSF蛋白質(zhì)組學(xué)的研究目前才剛剛起步。腦組織檢測通常只能在死后進行，即使是腦組織活檢因為其可創(chuàng)性也很難開展，而CSF在臨床上可較易獲得，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病蛋白質(zhì)組學(xué)研究的良好材料;而且，由于CSF與腦組織細(xì)胞外液直接相通，其化學(xué)成分與腦的細(xì)胞外液成分相似，并可與腦之間蛋白質(zhì)和多肽類物質(zhì)自由交換，CSF成分的變化和中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境的變化密切相關(guān)，通過CSF蛋白質(zhì)組學(xué)研究，可保證在對患者不造成傷害的情況下，獲得大量神經(jīng)系統(tǒng)疾病信息〔8〕。

但是，CSF蛋白質(zhì)組學(xué)的研究在樣品處理上存在著與其他組織和細(xì)胞所不同的自身特點:首先，CSF中鹽的成分含量很高，大于150 mmol/L，在雙向電泳前必須被去除或者顯著降低其濃度，因為高鹽成分所攜帶的高電流會干擾蛋白質(zhì)的電泳分離從而降低雙向電泳的蛋白質(zhì)分離效率。樣品溶解后，水化液中鹽濃度應(yīng)控制在10 mmol/L以下，因此在雙向電泳前應(yīng)去除80%的鹽分〔9〕。其次，CSF中蛋白質(zhì)的含量相當(dāng)?shù)停c血液中蛋白質(zhì)含量之比大約是4×10－3，僅為200～700 μg/ml，因此，在雙向電泳上樣前，CSF中的蛋白質(zhì)必須經(jīng)過濃縮。而且，CSF中白蛋白的含量約占CSF總蛋白的50%以上，免疫球蛋白占15%以上，高豐度蛋白的出現(xiàn)大大干擾了低豐度蛋白的檢出率，而與很多疾病相關(guān)的蛋白恰恰又是一些低豐度蛋白質(zhì)，因此，在雙向電泳前，如何對CSF蛋白質(zhì)進行預(yù)分餾就成為富集低豐度蛋白質(zhì)的關(guān)鍵問題〔10，11〕。

3 CSF蛋白質(zhì)組學(xué)在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用

目前主要集中在以下幾個方面:Hammack等〔12〕通過蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對比測定了3例多發(fā)性硬化(Multiple Sclerosis，MS)患者和3例非MS炎性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者的CSF蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)軟骨酸性蛋白(CRTAC-IB)、血漿酶原結(jié)合蛋白(tetranectin)、鈣結(jié)合細(xì)胞信號糖蛋白(SPARC-like protein)和磷酸二酯酶(autotaxin t)在MS組CSF中的異常表達(dá)，推測以上4種差異蛋白的表達(dá)可能與MS的發(fā)病機制有關(guān);2003年，Puchades等〔13〕對老年性癡呆(Alzheimer＇s Disease，AD) 患者CSF進行了蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)載脂蛋白A1(ApoA1)、載脂蛋白 E(ApoE)、載脂蛋白 J(ApoJ)、β-微量蛋白(beta-trace)、視黃醇結(jié)合蛋白(retinol-binding protein)、激肽原(kininogen)、α-1抗胰蛋白酶(alpha-1 antitrypsin)、細(xì)胞周期程序蛋白8(cell cycle progression 8 protein)及α-1β糖蛋白(alpha-1beta glycoprotein)在AD組CSF中異常表達(dá)，為AD發(fā)病機制的研究提供了新方向;Unlu等〔14〕檢測了3例伴有皮質(zhì)下梗死和白質(zhì)腦病的常染色體顯性遺傳性腦動脈病 (cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy disease，CADASIL)患者和6例對照患者的CSF蛋白質(zhì)組，通過雙向電泳和質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)在CADASIL組CSF中補體因子B(complement factor B)的表達(dá)異常增高，提示補體途徑可能參與CADASIL的病理機制;2006年，Li等〔15〕對15例特發(fā)性正常壓力性腦積水(idiopathic normal pressure hydrocephalus，INPH)和12例對照患者的CSF進行了比較蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在INPH組CSF中富亮氨酸α-2-糖蛋白(leucine-rich alpha-2-glycoprotein，LRG)、α1-抗靡蛋白酶(alpha1-antichymotrypsin)、載脂蛋白 D(ApoD)、ApoJ、結(jié)合珠蛋白-α1(haptoglobin alpha1)、血漿白蛋白(serum albumin)和α1-微球蛋白(alpha-1-microglobulin)的表達(dá)異常，而且經(jīng)ELISA檢測進一步證實了LRG在INPH組CSF中顯著增高，從而提示LRG可能成為INPH診斷和治療的特異性標(biāo)記物;2006年，Pasinetti等〔16〕通過蛋白質(zhì)組的方法在肌萎縮側(cè)索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis，ALS)患者CSF中研究發(fā)現(xiàn)半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cystatin C)及神經(jīng)分泌蛋白血管生長因子(VGF)的表達(dá)降低，提出CSF中cystatin C及VGF的下降有望為ALS的鑒別診斷提供客觀的生物標(biāo)記。

4 GBS CSF 蛋白質(zhì)組學(xué)

長期以來，CSF蛋白總量的增加一直是GBS的典型特征，在GBS發(fā)病的最初，CSF的常規(guī)生化檢查通常是正常的，但是在發(fā)病1 w以后，CSF中蛋白質(zhì)的含量逐漸增加，甚至高于正常的數(shù)倍至數(shù)十倍，這一特征性的改變，現(xiàn)已成為臨床上診斷GBS的一個可靠指標(biāo)〔17〕。80年代以來，國內(nèi)外學(xué)者在GBS患者CSF蛋白質(zhì)方面做了大量研究，Petzold等〔18〕發(fā)現(xiàn)GBS患者CSF中病理性升高的神經(jīng)絲(neurofilament)蛋白可能預(yù)示患者運動功能恢復(fù)不良;Yonekura等〔19〕發(fā)現(xiàn)在GBS患者CSF中抗熱休克蛋白的抗體(anti-heat shock protein antibodies)的升高。但是，有關(guān)GBS患者CSF蛋白質(zhì)的研究一直是針對單一或少數(shù)幾種蛋白質(zhì)的分割式研究，有關(guān)GBS患者CSF蛋白質(zhì)組學(xué)的整體研究目前仍較少見。

本文前期研究〔20〕首次應(yīng)用差異凝膠雙向電泳(2-D DIGE)結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸/電離-飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)，通過蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法對GBS患者CSF進行了整體分析，并且首次報道了GBS患者CSF中存在6種差異蛋白，分別為:結(jié)合珠蛋白(haptoglobin，Hp)、ApoA-IV(Apolipoprotein AIV，ApoA-IV)、蛋白2044(未命名蛋白)及轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(transthyretin，TTR)、ApoE、纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)g)。其中，Hp、ApoA-IV及蛋白2044在GBS組CSF中顯著增高，而TTR、ApoE及Fg則明顯降低。幾乎同期，德國Ulm大學(xué)的Lehmensiek等〔21〕也發(fā)現(xiàn)了GBS患者GSF中的Hp、絲氨酸/蘇氨酸激酶 10(serine/threonine kinase 10)、α-1-抗胰島素(α-1-antitrypsin)、癌相免基因(SNC73)、α-II-血影蛋白(alpha II spectrin)、免疫球蛋白G kappa鏈(IgG kappa chain)、組織蛋白酶D前蛋白(cathepsin D preprotein)表達(dá)上調(diào)，而轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin)、caldesmon、腸相關(guān)淋巴組織(GALT)、人類熱休克蛋白70(human heat shock protein 70)、心臟淀粉樣蛋白127aa肽段(amyloidosis HL-heart-peptide 127aa)、TTR表達(dá)下調(diào)。2010年，意大利科學(xué)家D＇Aguanno等〔22〕發(fā)現(xiàn)GBS患者GSF中一些炎癥相關(guān)蛋白如維生素D結(jié)合蛋白(vitamin D-binding protein)、β-2-糖蛋白I(beta-2 glycoprotein I，ApoH)及補體C3的水平升高，而TTR、ApoE、白蛋白及其5種組分水平下降，并發(fā)現(xiàn)GBS患者CSF中的白蛋白及α-糖蛋白對羥基化作用的敏感性增加，而且CSF中IgM選擇性增加了對羥基化Fab的反應(yīng)，說明氧化應(yīng)激可能參與了GBS的免疫病理機制。2008年，山東大學(xué)的楊銀榮等〔23〕發(fā)現(xiàn)GBS患者腦脊液中的cystatin C表達(dá)下調(diào)。

5 展望

雖然蛋白質(zhì)組學(xué)的出現(xiàn)為GBS患者CSF的研究提供了有利的手段，但是截至目前，有關(guān)GBS CSF蛋白質(zhì)組學(xué)的研究還停留在發(fā)現(xiàn)科學(xué)上，即發(fā)現(xiàn)了哪些差異表達(dá)的蛋白，是含量增高了還是降低了，而具體是否與GBS的發(fā)病相關(guān)，即差異蛋白在GBS發(fā)病中的作用尚未闡明。而且在GBS發(fā)病過程中，血漿中的蛋白質(zhì)很可能通過破壞的血神經(jīng)屏障泄漏進入CSF，這將會在一定程度上影響CSF蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)現(xiàn)。因此在將來的實驗中，有必要對所發(fā)現(xiàn)的差異蛋白的CSF蛋白質(zhì)指數(shù)測定(計算公式:CSF蛋白質(zhì)指數(shù)=proteinCSF/proteinserum:albuminCSF/albuminserum)，可明確CSF中這些差異蛋白質(zhì)的來源，即是來源于血漿還是鞘內(nèi)合成。同時，需深入研究差異蛋白與GBS疾病發(fā)病機制之間的關(guān)系，期望找尋到GBS的特異性診治靶點。

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