格林-巴利綜合征腦脊液蛋白質組學的研究進展

金 濤 孫 莉 張 穎 (吉林大學第一醫院神經內科，吉林 長春 130021)

格林-巴利綜合征(Guillain-Barre Syndrome，GBS)是一種急性炎癥性自身免疫性周圍神經病，以周圍神經和神經根脫髓鞘、軸索變性及小血管周圍淋巴細胞和巨噬細胞浸潤所致的炎性反應為主要病理特點。目前，GBS的病因及發病機制尚未完全闡明，臨床上也缺乏特異有效的治療手段，但鑒于大多認為本病是由細胞免疫和體液免疫共同介導的一種自身免疫性疾病，故采取有針對性的免疫治療可通過抑制自身免疫反應，減輕神經損害、促進神經再生〔1〕。糖皮質激素具有抗炎及免疫抑制作用，在GBS的治療中曾廣泛使用;但資料顯示常規激素治療并不能阻止GBS病情發展及縮短病程，而且會增加激素治療引起諸多副作用的風險，故現已不推薦用于GBS的治療〔2〕。血漿置換(plasma exchange，PE)是最早證實對GBS有效的免疫治療，可去除患者血漿中的抗體、免疫復合物、炎性介質等致病物質，從而減輕對周圍神經的損傷，達到延緩GBS病情進展及縮短病程的作用〔3〕;但是，PE治療需要特殊設備，技術要求高，且為有創治療，臨床應用受到很大限制。靜脈注射免疫球蛋白(IVIG)療法，由于其免疫替代及免疫調節的雙重作用，能夠增強機體的抗感染能力，明顯有利于神經功能的恢復〔4〕，但是，IVIG價格昂貴，而且存在血制品應用的一系列風險。總之，目前以GBS發病機制為依據所進行的免疫治療，療效尚不夠穩定，個體差異懸殊，預后也很難估計，使GBS的醫療救治工作面臨很大的困難。

1 蛋白質組學簡介

近年來，蛋白質組學的發展日新月異，正越來越廣泛的應用于科學研究及臨床工作中。廣義上講，蛋白質組(Proteome)是指“一種細胞、組織、體液或完整的生物體所擁有的全套蛋白質”〔5〕。蛋白質組學(Proteomics)則是以蛋白質組為研究對象，大規模、有系統地研究蛋白質的特征及結構，包括蛋白質的表達水平、氨基酸序列、翻譯后修飾及蛋白質間的相互作用等，從而在蛋白質水平上研究生物體的各種生理生化過程以及疾病的病理過程〔6〕。目前蛋白質組學的基本技術是利用雙向電泳(two-dimensional electrophoresis，2-DE)對全部蛋白質進行分離，然后通過質譜等技術對蛋白點進行鑒定。運用蛋白質組學研究技術，比較病變組織(細胞或體液)與其起源的正常組織(細胞或體液)或疾病發展不同階段組織中蛋白質在表達數量、表達水平和修飾狀態上的差異，可以發現與病變相關的特異蛋白質，它們不僅可為研究疾病發病機制提供線索，而且可作為疾病診斷和治療的生物標志物〔7〕。

2 腦脊液(CSF)蛋白質組學的特性

在神經科學方面，蛋白質組學的研究已廣泛應用于腦組織及細胞培養中，但是，有關CSF蛋白質組學的研究目前才剛剛起步。腦組織檢測通常只能在死后進行，即使是腦組織活檢因為其可創性也很難開展，而CSF在臨床上可較易獲得，是中樞神經系統疾病蛋白質組學研究的良好材料;而且，由于CSF與腦組織細胞外液直接相通，其化學成分與腦的細胞外液成分相似，并可與腦之間蛋白質和多肽類物質自由交換，CSF成分的變化和中樞神經系統微環境的變化密切相關，通過CSF蛋白質組學研究，可保證在對患者不造成傷害的情況下，獲得大量神經系統疾病信息〔8〕。

但是，CSF蛋白質組學的研究在樣品處理上存在著與其他組織和細胞所不同的自身特點:首先，CSF中鹽的成分含量很高，大于150 mmol/L，在雙向電泳前必須被去除或者顯著降低其濃度，因為高鹽成分所攜帶的高電流會干擾蛋白質的電泳分離從而降低雙向電泳的蛋白質分離效率。樣品溶解后，水化液中鹽濃度應控制在10 mmol/L以下，因此在雙向電泳前應去除80%的鹽分〔9〕。其次，CSF中蛋白質的含量相當低，與血液中蛋白質含量之比大約是4×10－3，僅為200～700 μg/ml，因此，在雙向電泳上樣前，CSF中的蛋白質必須經過濃縮。而且，CSF中白蛋白的含量約占CSF總蛋白的50%以上，免疫球蛋白占15%以上，高豐度蛋白的出現大大干擾了低豐度蛋白的檢出率，而與很多疾病相關的蛋白恰恰又是一些低豐度蛋白質，因此，在雙向電泳前，如何對CSF蛋白質進行預分餾就成為富集低豐度蛋白質的關鍵問題〔10，11〕。

3 CSF蛋白質組學在神經系統疾病中的應用

目前主要集中在以下幾個方面:Hammack等〔12〕通過蛋白質組學的方法對比測定了3例多發性硬化(Multiple Sclerosis，MS)患者和3例非MS炎性中樞神經系統疾病患者的CSF蛋白質的表達情況，發現軟骨酸性蛋白(CRTAC-IB)、血漿酶原結合蛋白(tetranectin)、鈣結合細胞信號糖蛋白(SPARC-like protein)和磷酸二酯酶(autotaxin t)在MS組CSF中的異常表達，推測以上4種差異蛋白的表達可能與MS的發病機制有關;2003年，Puchades等〔13〕對老年性癡呆(Alzheimer＇s Disease，AD) 患者CSF進行了蛋白質組學的研究，結果發現載脂蛋白A1(ApoA1)、載脂蛋白 E(ApoE)、載脂蛋白 J(ApoJ)、β-微量蛋白(beta-trace)、視黃醇結合蛋白(retinol-binding protein)、激肽原(kininogen)、α-1抗胰蛋白酶(alpha-1 antitrypsin)、細胞周期程序蛋白8(cell cycle progression 8 protein)及α-1β糖蛋白(alpha-1beta glycoprotein)在AD組CSF中異常表達，為AD發病機制的研究提供了新方向;Unlu等〔14〕檢測了3例伴有皮質下梗死和白質腦病的常染色體顯性遺傳性腦動脈病 (cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy disease，CADASIL)患者和6例對照患者的CSF蛋白質組，通過雙向電泳和質譜鑒定發現在CADASIL組CSF中補體因子B(complement factor B)的表達異常增高，提示補體途徑可能參與CADASIL的病理機制;2006年，Li等〔15〕對15例特發性正常壓力性腦積水(idiopathic normal pressure hydrocephalus，INPH)和12例對照患者的CSF進行了比較蛋白質組學的研究，結果發現在INPH組CSF中富亮氨酸α-2-糖蛋白(leucine-rich alpha-2-glycoprotein，LRG)、α1-抗靡蛋白酶(alpha1-antichymotrypsin)、載脂蛋白 D(ApoD)、ApoJ、結合珠蛋白-α1(haptoglobin alpha1)、血漿白蛋白(serum albumin)和α1-微球蛋白(alpha-1-microglobulin)的表達異常，而且經ELISA檢測進一步證實了LRG在INPH組CSF中顯著增高，從而提示LRG可能成為INPH診斷和治療的特異性標記物;2006年，Pasinetti等〔16〕通過蛋白質組的方法在肌萎縮側索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis，ALS)患者CSF中研究發現半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cystatin C)及神經分泌蛋白血管生長因子(VGF)的表達降低，提出CSF中cystatin C及VGF的下降有望為ALS的鑒別診斷提供客觀的生物標記。

4 GBS CSF 蛋白質組學

長期以來，CSF蛋白總量的增加一直是GBS的典型特征，在GBS發病的最初，CSF的常規生化檢查通常是正常的，但是在發病1 w以后，CSF中蛋白質的含量逐漸增加，甚至高于正常的數倍至數十倍，這一特征性的改變，現已成為臨床上診斷GBS的一個可靠指標〔17〕。80年代以來，國內外學者在GBS患者CSF蛋白質方面做了大量研究，Petzold等〔18〕發現GBS患者CSF中病理性升高的神經絲(neurofilament)蛋白可能預示患者運動功能恢復不良;Yonekura等〔19〕發現在GBS患者CSF中抗熱休克蛋白的抗體(anti-heat shock protein antibodies)的升高。但是，有關GBS患者CSF蛋白質的研究一直是針對單一或少數幾種蛋白質的分割式研究，有關GBS患者CSF蛋白質組學的整體研究目前仍較少見。

本文前期研究〔20〕首次應用差異凝膠雙向電泳(2-D DIGE)結合基質輔助激光解吸/電離-飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)，通過蛋白質組學研究方法對GBS患者CSF進行了整體分析，并且首次報道了GBS患者CSF中存在6種差異蛋白，分別為:結合珠蛋白(haptoglobin，Hp)、ApoA-IV(Apolipoprotein AIV，ApoA-IV)、蛋白2044(未命名蛋白)及轉甲狀腺素蛋白(transthyretin，TTR)、ApoE、纖維蛋白原(fibrinogen，Fg)。其中，Hp、ApoA-IV及蛋白2044在GBS組CSF中顯著增高，而TTR、ApoE及Fg則明顯降低。幾乎同期，德國Ulm大學的Lehmensiek等〔21〕也發現了GBS患者GSF中的Hp、絲氨酸/蘇氨酸激酶 10(serine/threonine kinase 10)、α-1-抗胰島素(α-1-antitrypsin)、癌相免基因(SNC73)、α-II-血影蛋白(alpha II spectrin)、免疫球蛋白G kappa鏈(IgG kappa chain)、組織蛋白酶D前蛋白(cathepsin D preprotein)表達上調，而轉鐵蛋白(transferrin)、caldesmon、腸相關淋巴組織(GALT)、人類熱休克蛋白70(human heat shock protein 70)、心臟淀粉樣蛋白127aa肽段(amyloidosis HL-heart-peptide 127aa)、TTR表達下調。2010年，意大利科學家D＇Aguanno等〔22〕發現GBS患者GSF中一些炎癥相關蛋白如維生素D結合蛋白(vitamin D-binding protein)、β-2-糖蛋白I(beta-2 glycoprotein I，ApoH)及補體C3的水平升高，而TTR、ApoE、白蛋白及其5種組分水平下降，并發現GBS患者CSF中的白蛋白及α-糖蛋白對羥基化作用的敏感性增加，而且CSF中IgM選擇性增加了對羥基化Fab的反應，說明氧化應激可能參與了GBS的免疫病理機制。2008年，山東大學的楊銀榮等〔23〕發現GBS患者腦脊液中的cystatin C表達下調。

5 展望

雖然蛋白質組學的出現為GBS患者CSF的研究提供了有利的手段，但是截至目前，有關GBS CSF蛋白質組學的研究還停留在發現科學上，即發現了哪些差異表達的蛋白，是含量增高了還是降低了，而具體是否與GBS的發病相關，即差異蛋白在GBS發病中的作用尚未闡明。而且在GBS發病過程中，血漿中的蛋白質很可能通過破壞的血神經屏障泄漏進入CSF，這將會在一定程度上影響CSF蛋白質組學的發現。因此在將來的實驗中，有必要對所發現的差異蛋白的CSF蛋白質指數測定(計算公式:CSF蛋白質指數=proteinCSF/proteinserum:albuminCSF/albuminserum)，可明確CSF中這些差異蛋白質的來源，即是來源于血漿還是鞘內合成。同時，需深入研究差異蛋白與GBS疾病發病機制之間的關系，期望找尋到GBS的特異性診治靶點。

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