同種異體大鼠骨髓間充質干細胞移植對放射性空腸損傷的修復作用

宋祥福，孫冰雪，張靜春，龔守良

（1.吉林大學公共衛生學院衛生部放射生物學重點實驗室，長春 130021；2.吉林大學生命科學院藥物制劑，長春 130021；3.吉林大學中日聯誼醫院檢驗科，長春 130033）

腹部接受一定劑量射線照射后，小腸因其黏膜上皮生長代謝活躍，對電離輻射最為敏感，而成為受損傷的主要器官。放射性腸損傷疾病在治療中存在著很大的困難，目前多以對癥治療為主。MSCs具有強大的增殖能力和多向分化潛能，免疫原性弱，易從骨髓中分離、純化及體外擴增等特點，因此是異體組織修復的理想的種子細胞。創傷可以刺激MSCs遷移至受損器官或組織，并有助于受損組織修復和重建［1］。為此，本研究擬通過體外培養擴增大鼠MSCs后注入放射性空腸損傷模型大鼠，觀察其移植后對空腸組織修復情況，為其臨床應用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

DMEM培養基（Gibco公司）、胎牛 血清（Hyclone公司）、胰蛋白酶（Gibco公司）和4，6-2-苯基吲哚（4，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（Sigma公司）。倒置顯微鏡（日本Olympus）、冰凍切片機（德國萊卡）、激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus）。

1.2 MSCs分離、純化與體外培養與標記

選用5d大鼠乳鼠（8.0～10.0g），頸椎脫臼法處死，75％酒精浸泡5min，無菌條件下快速分離股骨和肱骨，剪除骨兩端，用5.0mL L-DMEM培養基，反復沖洗骨髓腔內骨髓于培養皿內，經反復吹打制成單細胞懸液，加入L-DMEM培養液（含15％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素）以1.0×105/mL接種于50mL培養瓶中，37℃5％CO2飽和濕度孵箱培養，3d后第一次半量換液，以后換液依具體情況而定，細胞接近90％融合時，按1.5×104/mL傳代。倒置顯微鏡逐日觀察，直至貼壁細胞融合鋪滿瓶底，重復以上操作，反復傳代擴增。參照文獻［2］的方法選取第三代MSCs于注入前1d進行標記的MSCs DAPI標記，并應用流式細胞術檢測細胞表型，應用成骨細胞誘導液和脂肪樣細胞誘導液誘導MSCs定向分化，鑒定其分化能力。

1.3 放射性腸損傷動物模型制作

選用成年Wistar雌性大鼠40只，清潔級，合格證號SCXK（吉）2003-0007體重240～260g。動物稱重后10％水合氯醛麻醉（3.5mL/kg），仰臥在特制的固定盒中，以貴陽醫療儀器廠生產的X.S.S.Z 250型深部X線機給予全腹部照射，大鼠腹部給予1cm的組織補償，從劍突到恥骨聯合，照射面積8.5cm×8.5cm，源皮距60cm，單次照射劑量5Gy，每隔72h照射1次，共5次。

1.4 動物分組及處理

將輻射大鼠隨機分為MSCs治療組（12只）和模型組（12只）和DAP標記組（4只），另設正常對照組（12只）。取4只模型大鼠，于第3次照后靜脈注射DAPI標記的MSC，分別在照射后2和7d取空腸，共聚焦顯微鏡觀察富集情況，每個時間點2只。MSCs治療組大鼠分別于第3、4、5次照射后，當日尾靜脈注射同種異體間充質干細胞1mL，濃度1×106細胞/mL。正常對照組和輻射組不做其他處理，于最后一次注射MSCs后7d和30d處死各組動物，病理學觀察空腸組織結構。

2 結果

2.1 大鼠骨髓MSCs的分離培養

培養1d后，大部分細胞呈圓形貼壁，2d可見有少數細胞開始伸出突起，呈梭形和多形性，3d后，許多細胞呈梭形貼壁，部分細胞可見脂肪滴樣空泡，待換液后細胞生長速度加快，潛伏期約為6～24h，對數生長期約為2～5d，接種后6～7d進入平臺期。細胞到第3代時，細胞長梭形，折光性強，細胞邊界清楚，細胞排列有一定的方向性，呈放射狀、或旋渦樣排列。經流式細胞儀檢測MSCs表面不表達CD34，成骨樣細胞誘導體系誘導后，堿性磷酸酶染色深染，脂肪誘導體系后，細胞內可見脂滴（圖1，見彩插3）。體外DAPI標記的MSC胞核呈明亮藍色熒光。

2.2 MSCs在大鼠空腸組織內的富集

激光共聚焦顯微鏡觀察發現MSCs注入2d切片背景出現熒光；7d時切片小血管壁呈現較強熒光（圖2，見彩插3）。

2.3 各組大鼠空腸組織學觀察

正常大鼠空腸黏膜結構清楚，隱窩深遂，腺體豐富；模型組7d黏膜上皮細胞壞死脫落，隱窩幾乎完全破壞，治療組7d黏膜壞死組織較少，黏膜增厚；30d模型組小腸出現間質纖維增多；30d治療組核分裂相增加，黏膜增厚，絨毛逐步再生，較模型組增加明顯。間質纖維增多減少，隱窩結構基本清楚（圖3）。

A：正常組；B：模型組7d；C：MSCs治療組7d；D：模型組30d；E：MSCs治療組30d圖3 普通光學顯微鏡下各組小鼠空腸組織學形態A：Normal group；B：Irradiation group，7d；C：MSCs group，7d；D：Irradiation group，30d；E：MSCs group，30dFig.3 Histological appearance of the jejunal tissue.HE staining

3 討論

腸黏膜受損后腸道干細胞可沿著隱窩絨毛軸分化為成熟細胞，取代受損脫落和凋亡的細胞，參與腸道損傷的修復［3］。據此推測，在腸道發生急慢性損傷時，調整小腸干細胞的再生或外源性輸入干細胞可能成為一種新型的治療方法，有望加速黏膜上皮修復和胃腸功能的恢復。

MSCs是一種成體多能干細胞，具有巨大增殖潛能，能向多種類型的細胞分化。王蓓等［4］用腸壁固有層和黏膜下層的結締組織成功誘導MSCs分化成為上皮細胞，并具有腸上皮細胞的表型。Jiang等［5］發現，在體外誘導條件下，小鼠MSCs能橫向分化成胃腸道上皮細胞。既然骨髓間充質干細胞在體外可以在誘導因子的作用下向腸上皮細胞轉化。那么，也有理由認為，骨髓間充質干細胞進入體內后，也可以在適當的體內誘導環境中，根據生命體的需要向其急需的有再生需求的腸上皮細胞轉化，并增殖分化替代損傷或壞死的細胞，使得受損組織得以恢復。骨髓來源的MSC能夠在移植后準確定位于損傷部位，促進損傷部位的愈合［6］。研究者將同種異體骨髓間充質干細胞移植在腸缺血-再灌注損傷的動物模型中，發現骨髓間充質干細胞可在受體腸道內定植，并可加速腸道損傷的恢復［7］。曹曉滄等［8］將人臍帶間充質干細胞移植對小鼠輻射性腸道損傷模型體內5周后，發現移植細胞分布于腸黏膜淋巴組織內和腺上皮細胞間，小鼠的一般狀況和腸道病理學表現明顯改善。本研究結果與上述報道一致，把DAPI標記的MSCs移植入放射性空腸損傷的大鼠體內2d后，切片可見藍色熒光，7d時小血管壁呈現較強熒光，說明移植的MSCs通過血液循環遷移至受損的腸組織并參與再生修復，并且病理可見MSCs輸入后7d黏膜壞死組織較少，黏膜增厚，30d核分裂相增加，間質纖維增多減少，隱窩結構基本清楚，說明MSCs被趨化到受損傷的空腸組織，參與了腸道黏膜的修復過程。

有研究表明：移植的MSCs通過血液循環遷移至受損組織，能夠減輕炎癥對腸組織的損傷［9］，并且在損傷的局部MSCs能夠促進新生血管的生成，從而促進組織細胞的增殖［10］。也有研究者認為MSCs細胞也通過自分化、旁分泌和啟動內源性修復機制參與再生修復［11］。關于MSCs的對損傷組織的修復機制仍需進一步的研究。

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