植物原生質體全能性表達及其在甘藍類蔬菜育種上的應用

盛小光 顧宏輝 趙振卿 虞慧芳 王建升 張曉輝

（浙江省農業科學院蔬菜研究所，浙江 杭州 310021）

植物原生質體一詞始自 Hanstein（1880），即指通過質壁分離，能夠和細胞壁分開的那部分細胞物質。按照細胞全能性學說，離體的植物原生質體和其他起源的細胞一樣，在合適的離體培養條件下，具有繁殖、分化、再生成完整植株的能力。它的出現有力地促進了與之相關領域科學研究的進程，其在基礎研究及實際應用領域具顯著優勢。作為一種獨特無壁的單細胞體系，并且同一時間內能得到遺傳上同質的大量群體，為細胞生物學、發育生物學，甚至病毒學建立了試驗體系；同時在體細胞雜交、體細胞無性系變異篩選、遺傳轉化、種質的超低溫保存等方面具有廣闊的應用前景。在農業應用尤其在作物品種改良方面，原生質體全能性的順利表達是育種目的得以實現的關鍵和前提（趙大克 等，2009）。

Nagata和Takebe（1970）首次利用煙草葉片游離原生質體，經培養獲得再生植株，使原生質體的研究和應用進入了一個新的階段。尤其是有關培養過程中供試材料的諸多生理特性的研究，為原生質體培養提供了切實可行的理論依據，避免了培養過程中的盲目性，使原生質體培養技術日臻完善。目前，至少有46科160多屬360多種植物（包括變種和亞種）的原生質體再生體系得以建立（劉進平，2005）。多種因素影響原生質體全能性的實現，本文綜述了原生質體游離、培養和再生過程中的影響因素及其在甘藍類蔬菜育種上的應用。

1 原生質體全能性表達

1.1 外植體來源及生理狀態

選用的材料在很大程度上影響原生質體的游離效果。物種不同，則外植體的選擇也不同。

一般來說，雙子葉植物多選用葉片、下胚軸、子葉等器官作為游離材料。如擬南芥（Dovzhenko et al.，2003）、甘藍型油菜（Watanabe et al.，2002）等常用發芽5～7d的下胚軸或子葉，而煙草常用60～90d苗齡的新鮮葉片（Caboche，1980）；對于多數單子葉植物特別是禾本科植物來說，其原生質體再生體系絕大部分均由幼穗、未成熟胚以及種子盾片等來誘導愈傷組織和懸浮細胞系所建立（Yamada et al.，1986）。如在小麥（Pauk et al.，1994）、百合（Famelaer et al.，1996）、水稻（Tang et al.，2001）、香蕉（Assani et al.，2002）等作物中，只有選用愈傷組織和懸浮細胞系游離的原生質體才可以分裂、分化。

材料的生理狀況是影響原生質體質量的因素之一。生長季節、光照、肥水、滲透壓及溫度都顯著地影響原生質體的產量及活力。為調整材料的生理狀態，在原生質體游離之前，對供體進行預處理，有利于原生質體的游離。如在 15～25 ℃室溫和自然光照下培養的甘藍無菌苗下胚軸游離原生質體，原生質體產量為 1×106個·g-1（FW），而經 4 ℃低溫處理無菌苗，原生質體的產量可增加1倍（Thomas & Elizabeth，1990）。Wallin和Welander（1985）把蘋果葉片放在附加質量分數為5 %聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP），并添加0.5 μmol·L-1蛋氨酸的W5鹽-糖溶液中處理30min，原生質體的產量明顯提高。

1.2 材料酶解

酶是影響原生質體游離重要的因素之一，主要降解構成植物細胞壁的纖維素、半纖維素和果膠質。不同植物種類或同一植物的不同器官以及它們的培養細胞，由于細胞壁的結構組成不同，分解細胞壁所需的酶類也不同，而酶解處理就是要用合適的酶組合、最低的酶濃度和最短的酶解時間來獲得大量有活力的原生質體。用于植物原生質體分離的酶制劑基本上為纖維素酶和果膠酶，經常搭配使用的酶類還有半纖維素酶、崩潰酶和蝸牛酶。一般而言，纖維素酶濃度為1 %～2 %，果膠酶濃度為0.5 %～1.0 %（Tautorus & Fowke，1991；孫振久和井立軍，2001）。酶解pH一般為5.5～5.8（Sinha et al.，2003）。酶解時間從幾小時到幾十小時不等，但一般以不超過24h為宜（Ochatt，1987）。

1.3 原生質體的培養

獲得有活力的原生質體后，在合適的培養條件下，可再生出新的細胞壁，進而細胞進行持續分裂形成細胞團或愈傷組織，形成再生植株。但原生質體能否培養成功受多種因素的影響。

1.3.1 培養方法 原生質體培養方法和細胞培養類似，有液體淺層培養、固體包埋培養和固液結合培養。在這些培養方法的基礎上還衍生出了微（懸）滴培養、微型分離法培養、看護培養、念珠培養、瓊脂島培養等。每一種方法都有優缺點，應根據培養目的和材料的不同選擇不同的培養方法。在六出花（Motonobu et al.，1997）、月季（Suk et al.，2003）、天竺葵（Nassour et al.，2003）等原生質體培養中，液體培養基的效果優于固體培養基。何龍飛等（1996）進行普通白菜下胚軸原生質體培養時發現，固液雙層法的效果最好，有利于改善通氣，滿足原生質體發育所需營養，固相部分還可以吸附有害物質，從而提高了原生質體的分裂頻率。Pan等（2003，2004）研究表明，藥用植物藍刺頭（Echinops spinosissimus）葉肉原生質體的培養采用瓊脂糖包埋培養較優于液體淺層培養，具有更高的植板效率。

1.3.2 培養基 原生質體的培養基多采用以 MS和 B5培養基為基礎的改良培養基，如 KM8p和NT培養基等。一般pH值為5.6～5.8。實驗證明糖是原生質體培養中較理想的滲透壓穩定劑和碳源，常用的有甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖。近年來，有研究表明某些去離子表面活性劑（如聚醚 F-68）及“氧載體”（如全氟化碳和血紅蛋白）的添加可以提高原生質體的分裂頻率和植板效率，如在苦茄（Solanum dulcamara）的原生質體培養基中添加終濃度為0.1 %（W/V）的聚醚F-68，可以將植板效率比對照提高26 %（Lowe et al.，2001）。水稻懸浮細胞游離的原生質體培養中添加全氟化碳試劑后的植板效率比對照增加了5倍，并且這種促進作用存在于整個培養階段，使最終的芽再生頻率也比對照提高了12 %（Lowe et al.，2003）。

原生質體培養基中添加的激素種類主要有生長素類（常用的有萘乙酸、吲哚乙酸、吲哚丁酸、吲哚丙酸等），赤霉素類（常用的有赤霉酸）和細胞分裂素類（常用的有 6-芐基腺嘌呤、玉米素等）。不同植物原生質體培養對激素的種類和濃度的要求存在很大的差異，通常認為在原生質體的前期培養中，需生長素來誘導分裂；而后期的分裂分化中，則是細胞分裂素起主導的作用（Dudits & Fehér，2000）。

1.3.3 培養密度 原生質體培養的常規技術是群體培養，培養密度對細胞的生長十分重要，密度條件一般在5×103～5×105個·mL-1時，植物原生質體才能正常分裂與發育（Davey et al.，2005）。密度過高時，由于營養不足或細胞代謝物過多而抑制再生細胞的正常生長；密度過低時，原生質體再生細胞不能持續分裂，這可能是因為原生質體在培養過程中，本身會釋放具有與分裂有關的物質，原生質體密度過低，這種物質達不到一定的濃度而影響分裂（Horita et al.，2003）。Matsubayashi和Sakagami（1998）對蘆筍的研究發現，當原生質體培養的濃度低于每毫升5×104個時，則培養細胞根本不分裂；而黃籽甘藍原生質體培養的適宜密度為 6×103～6×104個·mL-1（李名揚和羅金華，1995）。

1.4 原生質體的再生

至今，雖然已有46科160多屬360多種植物（包括亞種、變種）的原生質體成功地獲得了再生植株，但主要集中在茄科、傘形科、十字花科、菊科、豆科和禾本科的幾個屬（劉進平，2005）。原生質體植株再生途徑通常有 3條：經細胞團發育形成愈傷組織，再分化成芽，進而長成植株；直接形成胚狀體，再發育成植株；先形成愈傷組織，再由愈傷組織分化形成胚狀體，最后發育成植株。胚狀體途徑分化成苗，可以避免愈傷過程可能給分化帶來的困難，而且能更好地保持再生植株的遺傳穩定性，避免愈傷化可能產生的倍性和染色體變異。目前只有蘆筍（Hisato & Masahiro，1990）、香蕉（Panis et al.，1993）等少數幾種植物是通過體細胞胚胎發生途徑再生成植株，多數植物還是先形成愈傷組織，然后分別誘導芽和根。

2 原生質體全能性表達在甘藍類蔬菜育種上的應用

甘藍（Brasscia oleracea L.）屬十字花科（Cruciferae）蕓薹屬（Brasscia），包括結球甘藍、羽衣甘藍、抱子甘藍、球莖甘藍、皺葉甘藍、花椰菜、青花菜、芥藍等多個變種，是普遍栽培的重要蔬菜作物（周慶紅 等，2003）。至今，原生質體全能性表達及以此為基礎的體細胞雜交和遺傳轉化技術在甘藍類蔬菜作物育種中已得到較為廣泛的運用。

2.1 利用原生質體培養進行遺傳轉化

目前甘藍外植體遺傳轉化主要以無菌苗的莖、芽、葉片、子葉、愈傷組織等為受體，取材容易，操作相對簡便，但由于受體多為多細胞系統，所形成的轉化植株多為嵌合體，這給目標性狀的純化和穩定遺傳帶來一定的困難。而原生質體是單細胞系統，沒有或較少受周圍細胞和微環境的影響，再生的植株也是由單細胞發育而來，性狀易純化且穩定遺傳。所以向原生質體導入外源基因比向其他外植體導入外源基因有更大的優勢。另一方面，由于原生質體去除了細胞壁的保護，可避免核酸酶對異體DNA的破壞，原生質體較易從外界攝入病毒、細菌、細胞器、蛋白質、核酸等，使得外源基因容易導入（Rakoczy-Trojanowska，2002），因此利用原生質體導入外源基因將為甘藍類蔬菜的基因轉化帶來一條新的途徑。Mukhopadhyal等（1991）報道甘藍下胚軸原生質體在聚乙二醇（PEG）的介導下，直接攝取了抗潮霉素（Hygromgcin）的標記基因的質粒DNA，轉化頻率10 %～33 %，而且獲得了轉化再生植株。楊仲南和許智宏（1994）通過PEG介導研究了外源GUS基因在花椰菜原生質體中的瞬間表達。薛紅衛和衛志明（1996）將GUS基因導入甘藍下胚軸原生質體并獲得轉基因植株。Eimert（1992）用花椰菜葉肉原生質體，通過電激法轉化得到了抗性芽。Radchuk等（2002）也利用花椰菜葉肉原生質體為受體，通過PEG介導的轉化方法獲得了轉基因陽性植株。

2.2 利用原生質體培養獲得無性系變異

由于原生質體無細胞壁，它對培養體系中理化因素的影響更為直接和敏感，且在培養條件下的代謝過程與在植株體內并不完全相同，所以在原生質體培養過程中容易產生無性系的變異，這些變異植株已廣泛應用于育種工作中。首先，產生的變異為選擇新優材料提供了可能，為品種選育提供了材料；其次，由于原生質體培養再生植株變異是在培養過程中發生的，不需經過其他特殊的操作和選擇。因此，能夠縮短育種年限，節約時間，加速育種進程；第三，在現有研究條件下，通過酶解法能夠分離得到大量的原生質體，使得變異發生面廣、幅度大、整齊度高而且穩定快，因而可以獲得大量的變異材料。熊新生等（1988）在甘藍原生質體再生植株中發現了二倍體、四倍體，同時也發現部分非整倍體。Sheng等（2011）在花椰菜下胚軸原生質體的再生植株中也發現了少量的四倍體和六倍體。

2.3 利用體細胞雜交創造新的遺傳變異

通過體細胞雜交產生體細胞雜種，為植物育種提供了一條克服生殖隔離，提高變異的新途徑。體細胞雜交可以在親緣關系比較遠的物種間或者在栽培種與野生種之間進行，并且細胞質和細胞核基因同時參與雜交，經過進一步選擇、回交，甚至繼續進行體細胞雜交，不僅有希望得到蔬菜新類型，還能夠豐富蔬菜種質資源。至今，通過原生質體融合已成功獲得甘藍（B.oleracea）與蕓薹（B. campestris）（Jourdan et al.，1989；Yamashita et al.，1989）、普通白菜（B. napus）（Yarrow et al.，1990）、蕪菁（B. rapa）（Cardi & Earle，1997）、芥菜（B. juncea）（Arumugam et al.，2000）、Brassica spinescens（姚星偉 等，2005）、黑芥（B. nigra）（張麗 等，2008）等蕓薹屬內及甘藍與Moricandia arvensis（Toriyama et al.，1987）、Moricandia nitens（Yan et al.，1999）、白芥（Sinapis alba）（Hansen & Earle，1997）、亞麻薺（Camelina sativa）（Hansen，1998）、紫羅蘭（Matthiola incana）（Sheng et al.，2008）等屬間的體細胞雜種植株，這些種間和屬間雜種為甘藍品種改良提供了十分豐富的變異類型和橋梁材料。

2.4 利用體細胞雜交創制雄性不育新種質

在育種上雜種優勢有極大的利用價值，而實現雜種優勢育種的最簡便和有效方法就是利用雄性不育系。目前，大部分蔬菜采用的都是細胞質雄性不育（Cytoplasmicmale sterility，CMS）的不育系。甘藍中的雄性不育源多為 Ogura胞質不育（又叫蘿卜胞質不育）。一般來說，有三種途徑獲得CMS性狀：一是自發產生CMS性狀；二是種內或種間有性雜交再回交，轉育CMS性狀；三是通過體細胞雜交獲得CMS性狀。自發產生CMS的頻率很低，且隨機性強，所以不方便利用。通過回交轉育CMS性狀在結球甘藍（方智遠 等，2001；劉玉梅 等，2002）、花椰菜（陳文輝 等，2010）等作物中已經有成功的例子。但所獲得的植株除了CMS特性以外，還常常伴有黃化、蜜腺發育不良、花形態異常和結實率低等異常現象。相關專家認為這些現象是異源細胞質與細胞核之間的不協調或者是異源親本葉綠體的不協調引起雜種細胞內的葉綠素缺失造成的。這些說法都涉及到細胞質，所以用有性雜交的方法難以彌補。通過體細胞雜交途徑進行品種間或物種間cmS性狀的轉移，則很少發生上述異?，F象。Kao等（1992）通過原生質體融合，獲得了具雄性不育的Ogura線粒體、青花菜葉綠體和細胞核的胞質雜種，這種胞質雜種雄性不育材料在低溫下不黃化，可用于F1種子生產。惠志明等（2006）應用非對稱體細胞雜交技術向花椰菜成功轉移了甘藍型油菜中的Ogura雄性不育胞質。

除了依靠原生質體融合轉移現有不育基因外，原生質體融合本身也可以產生不育的融合雜種。Kanno等（1997）利用非對稱體細胞雜交技術創造了具有CMS性狀的甘藍與蘿卜的屬間體細胞雜種，為了驗證CMS產生的機理，詳細分析了雜種葉綠體和線粒體的基因組，認為可能是親本的線粒體DNA發生重組產生嵌合體所致，也可能是正常的線粒體基因轉綠受阻引起的，同時也不排除由細胞核與細胞質不協調造成的。Motegi等（2003）應用可育的甘藍和可育的蘿卜，通過非對稱原生質體融合獲得了CMS甘藍，而且該CMS甘藍與紫甘藍回交9次仍表現不育性。 RFLP分析表明，該不育品系的mtDNA與OguraCMS型存在高度的結構相似性。

2.5 利用體細胞雜交創制抗?。ㄏx）新種質

甘藍類蔬菜在生產、貯藏和運輸中一直受到各種病蟲害的威脅，如黑斑病、根腫病、黑腐病和蚜蟲等，嚴重影響其產量和品質。甘藍的抗?。ㄏx）性大多是由多基因控制的數量遺傳性狀，而且在甘藍栽培種或其沒有生殖隔離的植物中很難找到抗源，即使個別品種有一定的抗性，其抗性水平也比較低。但在甘藍野生種中常常有很好的抗源，傳統的育種方法克服不了有性雜交的不親和性，因此很難利用這些野生植物中的抗源。體細胞雜交特別是非對稱體細胞雜交技術為甘藍類蔬菜抗?。ㄏx）育種提供了一條克服生殖障礙，縮短育種年限的捷徑。Hagimori 等（1992）利用體細胞雜交技術成功將蘿卜中的根腫病抗源轉移到花椰菜中，雜種的抗性與親本蘿卜基本一致。Hansen等（1997，1998）、Sigareva和Earle（1999）用不抗黑斑病的甘藍分別與對黑斑病高抗的野生植物歐白芥（Sinapis alba L.）和亞麻芥（Camelina sativa L.）進行體細胞雜交。在所獲得的體細胞雜種中均有對黑斑病高抗的個體，從而證明已將野生植物中對黑斑病的抗性轉入甘藍。張麗等（2008）和Wang等（2011）利用非對稱體細胞雜交技術獲得了大量花椰菜和黑芥的體細胞雜種，并成功將野生種質黑芥中的黑腐病抗性轉入栽培種花椰菜中。

體細胞雜交在甘藍類蔬菜抗蟲育種方面的應用雖然不多，但也有一些成功的例子。如姚星偉等（2005）和 Sheng等（2008）利用體細胞雜交技術向栽培種花椰菜中分別轉移了野生種質Brassica spinescens和紫羅蘭的蚜蟲抗性。

3 展望

甘藍類蔬菜是蕓薹屬作物中原生質體培養技術研究最為活躍的領域。近年來，甘藍類蔬菜原生質體培養和植株再生技術不斷完善，體細胞融合技術特別是非對稱細胞融合技術日趨成熟，為甘藍類蔬菜作物種間雜交和雄性不育等細胞質基因的轉育提供了技術保障，但是利用原生質體技術改良甘藍類蔬菜的遺傳性狀并將之運用于生產實踐中還有很大距離。原生質體技術本身也還存在著很多問題：①原生質體培養的穩定性和可重復性差，存在很強的經驗性。同時，原生質體再生植株頻率較低，存在很強的親本基因型限制，而原生質體植株再生的難易會直接影響體細胞雜交育種的成敗。②誘導融合過程中的許多因素如誘導物質的使用、融合方法的選擇等會直接影響到原生質體的活力和融合率，從而影響細胞雜交的效率。③體細胞雜種特別是非對稱體細胞雜種，其本身染色體數目不定，染色體結構發生變異，以及異常的減數分裂等造成雜種不育或育性極差的問題。

面對以上實際問題，今后的工作要加強原生質體培養技術的理論基礎研究，將細胞工程和分子生物學手段相結合，找出問題背后的相關調控機制，為改善和解決相關問題提供理論依據。今后應重點在以下幾個方面開展工作：①加強對原生質體培養和融合過程中的細胞遺傳學研究，比如核質關系、不親和性、細胞分裂的調控及細胞全能性表達和受阻的機理、遺傳物質的重組等，進一步從理論上解決原生質體全能性表達的親本基因型限制及原生質體融合雜種植株再生頻率低的問題。②加強對再生雜種植株的細胞學和分子生物學研究，特別是與育性相關的基因調控機制，為解決雜種育性極低或不育問題提供理論依據。③加強以原生質體為受體的遺傳轉化技術研究，為改良甘藍類蔬菜作物品質、抗逆性、產量等性狀提供一條新的途徑。

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