茄子單性結實候選基因的表達分析

張 映 劉富中 李香景 陳鈺輝 張振賢 方智遠 連 勇

（1中國農業大學農學與生物技術學院，北京 100193；2中國農業科學院蔬菜花卉研究所，北京100081）

茄子（Solanum melongenaL.）是喜溫作物，在溫室反季節栽培及春季露地早熟栽培條件下，開花期常由于低溫引起授粉受精不良，落花、落果，效益降低。茄子單性結實能克服低溫引起的落花落果障礙，坐果能力增強，產量顯著提高，同時還可改進果實品質，降低栽培成本（劉富中 等，2005；張映 等，2009）。因此，茄子單性結實特性的研究及單性結實基因的分離與克隆，對指導單性結實品種的育種工作，選育耐低溫、適宜保護地和露地早春栽培、優質無籽或少籽的茄子品種，具有重要的意義。目前，國內外研究者先后對茄子單性結實的特性（田時炳 等，1999；劉富中 等，2005）、內源激素的種類和含量變化（武彥榮 等，2009；張偉春 等，2009）、胚胎及果實發育的解剖特點（張偉春 等，2008）、遺傳規律（田時炳 等，2003；劉富中 等，2008）、AFLP分子標記（劉富中 等，2008；Shimomura et al.，2010）進行了研究，并通過轉入外源嵌合基因DefH9-iaaM獲得轉基因單性結實茄子（Rotino et al.，1997），但有關茄子單性結實形成的分子機制和單性結實相關基因的分離克隆尚未見報道。

筆者利用SSH技術構建了茄子單性結實果實不同發育時期的抑制差減cDNA文庫，含有2 347個陽性克隆，測序、序列拼接后，共獲得1 248個高質量的unigenes。本試驗對獲得的差異表達unigenes在NCBI數據庫中進行比對分析，并應用熒光定量PCR技術，研究10個差異表達unigenes在不同結實性果實中的表達特性，以期獲得茄子單性結實相關基因，為進一步克隆茄子單性結實基因，深入研究茄子單性結實基因的表達和調控機制及分子機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

茄子單性結實自交系D-10：在開花結果期間日最低溫度在7～15 ℃之間時，表現單性結實，果實內無種子，果實正常生長發育；當溫度適宜后，植株上部果實內產生種子。非單性結實自交系03-2：在開花結果期間日最低溫度在7～15 ℃之間時，果實不能正常膨大 （劉富中 等，2005）。試驗材料于2009年春定植于中國農業科學院蔬菜花卉研究所試驗地內。門茄開花結果期間日最低溫度在9～15 ℃之間，單性結實特性完全表達，產生無籽果實，非單性結實品系果實不能正常膨大。四門斗開花結果期間日最低溫度在 16～21 ℃之間，單性結實特性不表達，兩品系都產生正常有籽果實。分別取兩品系低溫時期（門茄）和適宜溫度時期（四門斗）開花前7 d、開花當天、開花后7 d和開花后20 d 4個時間點的子房或果實，迅速用液氮冷凍處理，置于-80 ℃冰箱中保存備用。

1.2 RNA的提取和cDNA的合成

單性結實品系和非單性結實品系的門茄和四門斗時期各取樣時間點均取 3個子房或果實作為一份材料，液氮研磨，用Omega的Plant RNA Kit提取總RNA。用1.0 %變性瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，利用紫外分光光度計法測定其濃度和純度。將每個時間點檢測合格的RNA取5 μg，應用SuperScriptTMⅢ反轉錄試劑盒（Invitrogen公司）合成cDNA第一鏈。

1.3 差減文庫序列分析

將測序結果去除載體和引物序列以后，使用Phrap軟件對Clean ESTs序列進行組裝得到unigenes，將unigenes在GenBank數據庫進行BLAST序列比對分析，將比對結果E值低于1e-5的unigenes視為已知基因。

1.4 差異表達序列熒光定量PCR分析

以番茄ubiquitin為內參基因（Cooper et al.，2004），選取 F1、Z351、Z358、Z569、Z599、Z603、Z613、Z622、Z626、Z707共10個差異表達unigenes，根據其核苷酸序列，應用Primer Premier5.0軟件，設計退火溫度為57 ℃左右，引物無錯配、二聚體和發卡結構，產物為400 bp以下的基因特異引物，并將其在oligo 6里進行驗證。通過PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測引物的有效性和特異性。

反應在LightCycler480熒光定量PCR儀（Roche）上進行，所有PCR都設3次重復。反應體系：總體積20 μL，模板8 μL，上下游引物各1 μL，SYBR Green Master Mix 10 μL。PCR 反應程序：95 ℃ 預變性 10 min，95 ℃ 10 s，57 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，45 個循環后作熔解曲線（95～65 ℃，0.1 ℃·s-1），實驗所用的方法為雙標法（唐永凱和賈永義，2008）。

標準曲線的制作：將ss cDNA（單鏈cDNA）模板按5-1、5-2、5-3、5-4、5-5的梯度濃度稀釋，分別擴增內參基因和差異表達序列，根據其 CT值獲得內參基因和差異表達序列的擴增效率和標準曲線。根據D-10和03-2的門茄和四門斗時期各取樣時間點的差異表達序列和內參基因的 CT值，結合標準曲線，得到不同結實性果實中不同時期的差異表達序列的相對表達量，使用Excel 2007軟件處理數據。

2 結果與分析

2.1 差異表達EST序列的比對分析

對所構建的抑制差減cDNA文庫中的陽性克隆，經過測序拼接獲得1 248個unigenes，其中singletons 981個，contigs 267個。將1 248個unigenes在GenBank數據庫上進行BLAST比對，比對結果中E值低于1e-5的有1 109個，占全部unigenes的88.86 %；與其他物種同源性低或者沒有可匹配的同源基因的unigenes所代表的可能是新基因，共139個，占11.14 %。筆者構建的茄子單性結實SSH-cDNA文庫中部分unigenes的BLAST結果見表1。

表1 SSH-cDNA文庫中的部分unigenes BLAST結果

2.2 熒光定量PCR基因特異引物設計

根據從構建的抑制差減文庫中挑選出的10條差異表達的unigenes的核苷酸序列（表2），利用Primer Premier 5.0設計退火溫度為57 ℃，產物小于400 bp的基因特異引物，以番茄ubiquitin為內參基因（Cooper et al.，2004），經瓊脂糖凝膠電泳檢測，確認其能有效擴增，且擴增產物為單一條帶，表明設計的引物具有特異性（表2），可用于熒光定量PCR分析。

表2 熒光定量PCR所用的基因特異性引物

2.3 相對定量標準曲線的建立

10個unigenes均以ubiquitin基因作為內參基因，作相對定量標準曲線。以梯度稀釋的模板進行PCR，構建各差異表達unigene和內參基因的標準曲線，并計算擴增效率（表3）。各差異表達基因的標準曲線都呈很好的線性關系，擴增效率都大于0.9，適合進行熒光定量比較。根據標準曲線方程，可以計算出要驗證的10個unigenes的相對表達量。

2.4 差異表達基因的實時熒光定量PCR分析

為了更準確地鑒定SSH文庫中差異表達基因的可靠性，推測單性結實的形成機理，選取9個已知功能的 unigenes（F1、Z351、Z569、Z599、Z603、Z613、Z622、Z626、Z707）和 1個功能未知的unigene（Z358）（表1），采用實時熒光定量PCR分析其在單性結實品系D-10和非單性結實品系03-2果實不同發育時期的表達情況（圖1）。由圖1可知，10個unigenes的表達情況大致可分為 3類：在單性結實品系D-10中特異表達的 unigenes，包括 Z358、Z569、Z599、Z603、Z626和Z707；在非單性結實品系03-2適溫條件下特異表達的unigenes，包括F1和Z613；在單性結實和非單性結實品系中非特異性表達的unigenes，包括Z351和Z622。

Z569在單性結實品系低溫（門茄）和適溫（四門斗）時期果實的發育過程中具有相同的表達規律。在開花前表達量逐漸升高，開花當天表達量最高，至開花后7 d，表達量逐漸減少，開花后7～20 d，表達量變化不大。Z569在單性結實品系低溫條件下的表達量高于在適溫條件下的表達量。Z569在單性結實品系低溫條件下（門茄）開花當天的表達量最高，約為適溫條件下單性結實品系和非單性結實品系果實中表達量的 2倍，為非單性結實品系低溫條件下表達量的3.08倍。因此，Z569可能在低溫下單性結實果實的發育過程中起重要的作用。

Z599在單性結實品系和非單性結實品系果實發育過程中的表達模式不同。在單性結實品系中，開花前的表達量高于開花后的表達量，開花當天的表達量最高；而在非單性結實品系中，表達量隨子房和幼果的發育逐漸下降。Z707在單性結實品系低溫條件下開花前的表達量逐漸下降，從開花當天起又逐漸升高，開花后7 d表達量最高，之后又逐漸下降，而在非單性結實品系的果實和單性結實品系適溫下的有籽果實的開花當天表達量最高，表明 Z707在單性結實品系低溫條件下特異表達。

在低溫條件下，Z603在單性結實品系中的表達量低于在非單性結實品系的表達量；而Z626在單性結實品系中的表達量高于非單性結實品系。Z358在單性結實品系不同結實性果實發育中的表達模式是逐漸下降，在低溫條件下開花前7 d的表達量變化不大；在非單性結實品系果實發育中的表達模式是在開花前逐漸上升，開花當天的表達量最高，開花后表達量逐漸下降。

F1在03-2四門斗有籽果實的開花前7 d和開花當天的表達量高于其他3種果實，在開花后7 d和20 d，4種不同結實性果實的表達量基本相同。Z613在03-2四門斗有籽果實中的表達模式是在開花前7 d至開花后7 d表達量逐漸減少，之后逐漸升高，在開花后7 d表達量最低。而在其他3種果實中的表達模式則是完全相反，先上升后下降，在開花后7 d表達量最高。

表3 差異表達基因標準曲線及其擴增效率

圖1 差異表達unigenes相對定量分析

Z351和Z622在單性結實和非單性結實品系不同果實的發育過程中的表達規律基本相同，其表達模式是下降—升高—下降，Z351在開花后7 d表達量最高（圖1）。

3 結論與討論

本試驗對前期構建的茄子單性結實抑制差減文庫中的一些重要的差異表達 unigenes序列進行分析，這些基因編碼的產物包括轉錄調控因子MADS-box transcription factor和AP2/ERF transcription factor，果實生長相關蛋白 pistil extension-like protein、methionine fulfoxide reductase和3-ketoacyl-CoA synthase，細胞組分histone H3.2 precursor和ribosomal protein，以及與植物成花相關的光受體Cryptochrome和Prf interactor等，涉及到果實發育的多個方面。獲得部分與其他物種同源性低或沒有可匹配的同源基因的 ESTs，可能是新基因。這些基因的功能有待進一步研究。

本試驗得到的在單性結實子房和果實中上調表達的Z569，與控制番茄果實膨大的E4基因同源性高達89 %，其翻譯產物是甲硫氨酸亞砜還原酶（Cordes et al.，1989）。E4基因在膨大的果實中表達量高（即合成甲硫氨酸亞砜還原酶），在突變的番茄品種rin（果實膨大受阻型）中，E4基因的轉錄水平只有正常果實的1/10（DellaPenna et al.，1989）。這是因為在膨大的果實中代謝旺盛，產生大量的活性氧，活性氧會導致細胞的失衡和組織的損壞，由于甲硫氨酸亞砜還原酶的修復作用，保護了果實膨大過程中的關鍵蛋白，使果實得以正常生長和發育（Sadanandom et al.，2000）。熒光定量分析表明，在低溫條件下，單性結實品系D-10門茄開花當天子房中的Z569表達量最高，為非單性結實品系03-2門茄子房中表達量的3.08倍，約為單性結實品系和非單性結實品系適溫條件下四門斗有籽果實表達量的2倍。前期試驗表明，單性結實品系D-10的單性結實性受低溫誘導表達（劉富中 等，2005），其單性結實果實的形成可能是Z569基因的大量表達，消除了低溫脅迫環境下（Berlett & Stadtman，1997）和果實膨大過程中（Dann & Pell，1989）產生的大量破壞性活性氧對一系列蛋白、脂肪和核酸的氧化作用，使子房正常發育成果實。因此推測Z569與單性結實相關。

Z707與乙烯合成和信號轉導途徑末端的乙烯響應因子序列為同源序列，乙烯響應因子作為表達調控因子，調控下游具有 GCC-box元件的基因的表達，從而實現性狀的表達和脅迫的響應（安豐英和郭衛紅，2006）。近年來在擬南芥和番茄中的研究證明，乙烯可通過調控生長素的作用以及通過乙烯信號轉導作用引起果實的自發膨大，形成單性結實（Vivian-Smith，2000；Linet al.，2008）。Z707在低溫條件下的單性結實品系中開花前下調表達，開花后上調表達，其可能通過調控乙烯的表達促進果實的發育。

Z599與番茄中軟木脂和果皮表面的蠟粉合成有關的3 -酮脂酰輔酶A合成酶相似（Leide et al.，2007）；Z603與組蛋白H2A相似，H2A具有維持核小體結構穩定性和染色質凝聚的作用，還可作為調節因子綁定到特需的蛋白質上，調節基因的表達；Z626是一種光敏色素相互作用因子，通過光信號的轉導對環境條件的改變發生響應（Jiaoet al.，2007）。熒光定量分析表明，Z599和 Z358在單性結實品系中特異表達，在低溫條件下，Z603在單性結實品系子房和果實的生長和發育過程中下調表達，Z626上調表達。這3個unigenes與功能未知的Z358在茄子果實中的具體功能、作用機制以及是否與單性結實相關還需要進一步的試驗驗證。

F1和Z613在03-2適溫條件下的四門斗果實中特異表達，可能與03-2四門斗果實中的種子數量最多有關。BLAST結果顯示F1與番茄中的單性結實相關基因Tm29相似性高達90 %，轉基因實驗和反義技術證明其可以引起單性結實（Ampomah-Dwamena et al.，2002）。基因Tm29與擬南芥中的MADS-box基因家族中的SEPALLATA1、SEPALLATA2和SEPALLATA3基因具有相似性，已從擬南芥中分離出與胚珠發育密切的SEP基因（Favaroet al.，2003），研究發現若使SEP的活性減少，其正常的胚珠和種子的發育被打亂，一些胚珠變成葉狀或心皮狀的結構，這些結果表明SEP基因對于正常的胚珠發育是必須的。因此，茄子單性結實果實中種子的缺失，可能是控制胚珠發育的SEP基因活性減小引起的。Z613與隱花色素同源，隱花色素在響應外界環境、開花調控和基因表達調節方面都具有重要作用（張小冰，2010），但其表達模式的改變是否調控果實的發育和種子的形成還需進一步研究。

非特異性表達的ungenes Z351和Z622則可能與單性結實無關。

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