異煙肼人體血藥濃度測定及藥代動力學研究

曾德貴，劉玉琴

(1.廣東省深圳市慢性病防治中心，廣東 深圳 518020; 2.北京大學深圳醫院，廣東 深圳 518048)

抗結核病藥異煙肼在臨床應用中可引起約20%的肺結核病患者出現肝功能變化。異煙肼進入人體后經酰胺酶催化，直接或間接生成肼(hydrazine)，肼可引起肝臟出現甘油三酯積聚、三磷酸腺苷(ATP)耗竭等毒性反應，是異煙肼致肝損傷的重要毒性代謝產物。結核桿菌對異煙肼極易產生耐藥性，并且隨著用藥時間的延長，異煙肼血藥濃度持續升高，易致結核病患者出現嚴重肝損傷，因此應在使用過程中進行血藥濃度監測[1－2]。目前，測定異煙肼血藥濃度有許多方法[3－5]，但大都存在提取率低、操作煩瑣的問題。筆者對以前的方法作了綜合改進，將異煙肼進行柱前衍生化，降低其極性，增強其紫外吸收，旨在建立一種靈敏度高、特異性好的反相高效液相色譜法以測定血漿中異煙肼的質量濃度。

1 儀器與試藥

LC－1型高效液相色譜儀(日本島津);TGL－16G型臺式高速離心機。異煙肼標準品(美國Sigma公司，批號為22409231);異煙肼片(沈陽紅旗制藥有限公司，規格為100 mg/片，批號為080615);香草醛、三氯醋酸、三乙胺、磷酸二氫鉀、甲醇均為國產分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱:YWG－C18柱(200 mm ×4.6 mm，5 μm);預柱:YWG－C18柱(25 mm ×6 mm，5 μm);流動相:V(0.02 mol/L KH2PO4)∶V(CH3OH)=61∶39，每 500 mL流動相加入 70%(V/V)的 HClO40.2 mL 及 20%(V/V)的三乙胺 0.4 mL;檢測波長:340 nm;流速:1 mL/min;進樣量:20 μL。在此色譜條件下，色譜峰峰形好、分離完全，血漿中內源性物質不干擾異煙肼的測定，異煙肼衍生物保留時間為11.08 min，香草醛保留時間為8.46 min，全程測定時間約13 min，色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 標準溶液配制

準確稱量異煙肼標準品10.0 mg，用甲醇定容于10 mL容量瓶中，得含異煙肼1 000 mg/L的標準貯備液。移取標準貯備液5.0 mL，稀釋至10 mL，配制成500 mg/L的異煙肼標準溶液備用。

2.3 血漿樣品采集與預處理

抽取健康人靜脈血，經高速(3 000 r/min)離心處理10 min后，吸取血漿，于－20℃下冷凍保存，作為空白血漿樣品備用。健康受試者單劑量口服異煙肼片300 mg后，在24 h內分12個時間段分別抽取靜脈血5.0 mL，高速(3 000 r/min)離心10 min分離血漿，吸取血漿，于－20℃下冷凍保存，作為異煙肼血漿樣本待測。取血漿樣品0.25 mL，置1 mL離心試管中，加100 g/L的三氯醋酸50 μL和16 g/L的香草醛溶液40 μL，然后加甲醇至總體積為0.5 mL。將上述溶液置40℃水浴反應20 min，冷卻，高速(1 000 r/min)離心5 min，吸取上清液20 μL進樣，按外標法定量。

2.4 方法學考察

標準曲線建立:取空白血漿0.25 mL共6份，分別加入質量濃度為 500 mg/L 的異煙肼標準溶液 0.2，0.8，2.0，4.0，8.0，12.0 μL，再分別加入100 g/L的三氯醋酸50 μL和16 g/L的香草醛溶液40 μL，加甲醇至 0.5 mL，制成質量濃度分別為 0.2，0.8，2.0，4.0，8.0，12.0 mg/L的溶液。異煙肼血漿樣本經預處理后，分別進樣20 μL，測出其峰面積。將峰面積(Y)對血漿樣品的質量濃度(X)進行線性回歸，得回歸方程 Y=2.93×105X－9.30×104，r=0.999 6(n=6)。結果表明，異煙肼質量濃度在0.2～12.0 mg/L范圍內與峰面積線性關系良好，最低定量濃度為0.2 g/L。

精密度試驗:按標準溶液配制方法精密配制異煙肼低、中、高3種質量濃度(0.8，4.0，12.0 mg/L)的溶液，依法進樣，連續測定 5 d，由測得質量濃度計算日間精密度，并于標準曲線建立的同天測定日內精密度。結果日內精密度 RSD分別為 2.6%，2.5%，2.4%(n=6);日間精密度 RSD 分別為 3.9% ，3.7% ，4.0%(n=5)。所得 RSD均在4.0%以內，表明精密度符合要求，測定方法可靠。

穩定性試驗:將含異煙肼的血漿樣品置－20℃低溫冰箱冷凍保存，30 d后測定含量。結果高、中、低3種質量濃度的樣品含量分別為 97.56%，99.28%，98.75% ，RSD 均在 3%以內，表明異煙肼的血漿樣品在－20℃低溫保存條件下至少30 d內含量保持穩定。

回收率試驗:依法操作，制備異煙肼低、中、高3種質量濃度(0.8，4.0，12.0 mg/L)的血漿樣品，按樣品預處理方法處理后，依法進樣測定質量濃度，計算回收率。結果見表1。

表1 異煙肼的回收率試驗結果(n=9)

2.5 異煙肼血漿濃度測定

10例男性健康受試者單劑量口服異煙肼片劑300 mg，分別在服藥前及服藥后的 0，0.33，0.67，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，7.00，9.00，12.00，24.00 h 經前臂靜脈取血 3 ～5 mL，立即置涂有肝素的離心管中，在避光處靜置10～20 min，以5 000 r/min轉速離心處理10 min，分離血漿，于－20℃冰箱保存待測。受試者給藥后避免劇烈運動，試驗期間禁煙、酒和含咖啡因的飲料。測定過程中，每日建立一條標準曲線，同時配制高、中、低3種質量濃度的質量控制樣本，每一質量濃度做雙樣本分析，以判斷當日結果的可靠性。按血漿樣品預處理方法處理并測定，10例受試者的平均血藥濃度－時間曲線見圖2。

圖2 10例受試者用藥后血漿平均藥物濃度－時間曲線

2.6 藥代動力學參數

將測得的濃度取均數，作為主數據通過3P97程序擬合，計算藥代動力學參數，達峰時間(tmax)和峰濃度(Cmax)采用實測值，用梯形法計算0～t藥－時曲線下面積(AUC0－t)和0－∞藥－時曲線下面積(AUC0－∞)，以半對數作圖法，由消除相末端濃度點計算半衰期(t1/2)。主要藥代動力學參數見表2。

表2 異煙肼的藥代動力學參數(± s，n=10)

表2 異煙肼的藥代動力學參數(± s，n=10)

3 討論

異煙肼有快代謝型和慢代謝型，因此建立快捷、高靈敏度的異煙肼血藥濃度監測方法很有意義。異煙肼極性大，在血漿中濃度低，所以在文獻[6]的基礎上采用異煙肼與香草醛的柱前衍生化反應，生成弱極性化合物異煙肼－香草醛腙，使異煙肼極性降低，易溶于有機溶劑，紫外吸收增強，提高了檢測靈敏度和專屬性。采用V(KH2PO4)∶V(CH3OH)=61∶39的流動相時，色譜峰峰形好、分離完全。另外，結核病患者往往同時服用利福平、吡嗪酰胺等幾種抗結核病藥，因而測試易受血漿中雜質和其他抗結核病藥的干擾。因此，還對利福平、吡嗪酰胺兩藥進行了干擾測試，在上述色譜條件下，利福平、吡嗪酰胺在340 nm波長處無吸收，對本方法無干擾。本研究為異煙肼的血藥濃度監測提供了一種靈敏、準確、方便的實驗方法。

[1]Dahl ML，Sjoqvist F.Pharmacogenetic methods as a complement to therapeutic monitoring ofantidipressantsand neuroleptics[J].TherDrug Monit，2000，22(1):114.

[2]Lennard L.Therapeutic drug monitoring of antimetabolic cytotoxic drugs[J].Br J Clin Pharmacol，1999，47(2):131.

[3]許赤鳴，陳 冰，王 潔，等.高效液相色譜法測定人血漿中異煙肼及乙酰異煙肼濃度[J].中國藥房，2005，16(13):1 001－1 002.

[4]黎昌權.高效液相色譜法測定異煙肼注射液的含量[J].中國藥業，2008，17(8):32－33.

[5]樂 江，彭仁琇，劉 娟.RP－HPLC法測定血漿中異煙肼代謝物的含量[J].中國藥科大學學報，2004，35(1):47－49.

[6]雷 勇，卓海通.用柱前衍生化法測定異福酰胺片中異煙肼的血藥濃度[J].中國醫院藥學雜志，2000，20(4):208.