反相高效液相色譜法測(cè)定苦豆子總堿中槐定堿含量＊

(廣東醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣東 東莞 523808)

苦豆子 Sophora alopecuroides L.為豆科槐屬多年生草本植物，主要分布于我國(guó)西北荒漠地區(qū)，生態(tài)適應(yīng)性強(qiáng)，資源豐富，其藥用部位為可再生的地上部分，味苦性寒，具有清熱解毒、祛風(fēng)燥濕、止痛殺蟲(chóng)等作用，在民間廣泛用于痢疾、腸炎等疾病[1]。苦豆子含有多種生物堿，其中苦參堿和槐定堿，槐果堿和苦豆堿，氧化苦參堿和氧化槐定堿，槐胺堿、新槐胺堿和異槐胺堿，3α－羥基槐定堿和脫氧槐定堿等均分別屬于同分異構(gòu)體，在不同條件下各成分間可能存在著生物轉(zhuǎn)化等[2]，分離難度較大。目前國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)對(duì)苦豆子總堿中槐定堿的含量測(cè)定方法所用色譜柱選擇條件較為嚴(yán)格。筆者采用NH2柱建立了苦豆子總堿中槐定堿的含量測(cè)定方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

HP－1100型高效液相色譜儀，G1315A型紫外－可見(jiàn)光二極管陣列檢測(cè)器;超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);德國(guó)Sartorious CP225D型萬(wàn)分之一天平。槐定堿對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，供含量測(cè)定用，批號(hào)為110784－200303);苦豆子總堿(批號(hào)為20070212，寧夏鹽池制藥有限公司);乙腈為色譜純，水為重蒸水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱:Kromasil100－5NH2柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈－ 磷酸水溶液(pH為2)－無(wú)水乙醇(80∶8∶10);檢測(cè)波長(zhǎng):205 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:30℃。理論板數(shù)按槐定堿峰計(jì)不得低于2 000。取對(duì)照品溶液和供試品溶液，用 0.45 μm 濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣 20 μL，記錄峰面積相應(yīng)值，以外標(biāo)法計(jì)算含量即可。高效液相色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

精密稱取槐定堿對(duì)照品5 mg，置50 mL量瓶中，用乙腈－無(wú)水乙醇(8∶1)流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，即得每1 mL含槐定堿對(duì)照品0.5 mg的對(duì)照品溶液。精密稱取苦豆子總堿6 mg，用乙腈－無(wú)水乙醇(8∶1)流動(dòng)相溶解，并定容至25 mL容量瓶中，得供試品溶液。取不含槐定堿的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:精密稱取對(duì)照品10 mg，置25 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為0.415 g/L的對(duì)照品貯備液，置冰箱中備用。分別精密吸取 5，2.5，1.25，0.625，0.025 L 對(duì)照品貯備液，置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別吸取不同質(zhì)量濃度的稀釋液20 μL，進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積對(duì)進(jìn)樣量(μg)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y=3 460.5X+15.521，r=1.000(n=5)。結(jié)果表明，槐定堿進(jìn)樣量在0.02～8.3 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

重復(fù)性試驗(yàn):精密吸取0.052 g/L的對(duì)照品溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣 6 次。結(jié)果平均峰面積為 3 581.74，RSD=0.3%(n=6)，表明儀器精密度良好。

重現(xiàn)性試驗(yàn):取同一批樣品，依法制備供試品溶液5份，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果平均含量為42.93%，RSD=2.61%(n=5)，表明分析方法重現(xiàn)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):精密吸取同一供試品溶液 20 μL，分別于 0，4，8，12，24，48，72 h 時(shí)進(jìn)樣，每次 20 μL。結(jié)果峰面積的 RSD=0.35%(n=7)，表明供試品溶液在72 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn):精密量取已知含量的苦豆子總堿3 mg，分別加入一定量的對(duì)照品貯備液，依法測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 槐定堿加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

2.4 樣品含量測(cè)定

取批號(hào)為070212的苦豆子總堿，依法制備供試品溶液并測(cè)定含量。結(jié)果3次測(cè)得的含量分別為43.3%，43.9%，41.0%，平均42.7%。

3 討論

苦豆子總堿是從豆科槐屬植物苦豆子的干燥全草或種子中提取的總生物堿。趙博光[3]報(bào)道，采用溶劑法提取，苦豆子總堿收率為1.55%，其中槐定堿收率為0.20%，苦參堿收率為0.06%，氧化苦參堿收率為0.006%，槐果堿收率為0.08%，槐胺堿收率為0.02%，苦豆堿收率為0.12%。槐定堿是苦豆子中含量較高的生物堿之一，占苦豆子總堿的20% ～60%，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗炎、抗心律失常、保護(hù)心肌、提高正性肌力等作用，是苦豆子總堿的主要活性成分，因此以槐定堿作為苦豆子總堿的質(zhì)量控制指標(biāo)。目前苦豆子總堿的質(zhì)量控制主要依據(jù)國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS－10001(HD－1391)－2003，該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定須使用Spherisorb氨基柱進(jìn)行苦豆子總堿中槐定堿的含量測(cè)定;文獻(xiàn)報(bào)道測(cè)定克瀉靈片中槐定堿的含量須用Hypesil SiO2柱，流動(dòng)相為乙醇－含0.01%二乙胺的甲醇溶液－正己烷(35∶35∶30)[4]。以上兩種文獻(xiàn)均對(duì)色譜柱有較嚴(yán)要求，特定型號(hào)的色譜柱限制了測(cè)定方法的應(yīng)用。筆者曾采用瑞典Kromasil 100－5 C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)、依利特公司 Hypersil ODS 柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)、安捷倫公司 Zorbax SB C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)等多種色譜柱及甲醇－水、乙腈－水、乙腈－醋酸銨等不同流動(dòng)相，結(jié)果獲得的圖譜效果欠佳。但C18柱子應(yīng)用較多，建議以后繼續(xù)深入研究。后采用Kromasil 100－5NH2柱，分別以甲醇－正己烷－冰醋酸、甲烷－正己烷－磷酸、甲醇－正己烷－氨水為流動(dòng)相，結(jié)果以乙腈－磷酸水溶液(pH為2)－無(wú)水乙醇(80∶8∶10)為流動(dòng)相分離效果好[5]。采用甲醇直接提取供試品，所含雜質(zhì)太多;用氯仿直接提取供試品，提取不完全。筆者采用WS－10001(HD－1391)－2003標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法中的樣品處理方法，操作簡(jiǎn)便，分離效果理想。本研究結(jié)果表明，采用Kromasil 100－5NH2柱所建立的方法分離度好，可用于苦豆子總堿中槐定堿的含量測(cè)定。

[1]洪 閣，劉培勛.槐屬植物生物堿化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].中草藥，2005，36(5):783.

[2]牟新利，王武寶，巴 杭，等.中藥苦豆子化學(xué)成分及生理活性的研究進(jìn)展[J].新疆師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2005，24(1):45－51.

[3]趙博光.苦豆草生物堿的研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，1989，15(3):1.

[4]蔡松濤，歐陽(yáng)惠芳，羅 杰.克瀉靈片中槐定堿的含量測(cè)定[J].中成藥，2004，26(5):附 6－附 7.

[5]Zhao W， Song L， Deng H，et al.Hydration，erosion，and release behavior of guar－based hydrophilic matrix tablets containing total alkaloids of Sophora alopecuroides[J].Drug Dev Ind Pharm，2009，35(5):594－602.