荷移－同步熒光光譜法直接測定血清中阿米卡星的含量

(江蘇省南通衛生高等職業技術學校，江蘇 南通 226007)

阿米卡星是一種抗菌譜廣的半合成氨基苷類抗生素，臨床上用于革蘭陰性桿菌主要為耐慶大霉素菌株所致較重的感染，屬濃度依賴性殺菌劑，臨床療效與血藥濃度有一定關系，但藥物濃度過高會產生一定的耳、腎毒副作用，且對神經肌肉接頭有阻滯作用[1]。為了科學合理、安全有效地使用該藥，應建立準確、快速的方法監測血液中藥物濃度。目前阿米卡星的含量測定方法為微生物法[2]，但該法繁冗費時、費用高，不適于快速檢測;鎳毛細管電泳法[3]、電化學方法[4]、分光光度法[5]、旋光法[6]、熒光法[7]、共振瑞利散射法[8]等也曾用于阿米卡星的測定，其中應用最多的是分光光度法，該法所用儀器價廉、操作簡易，但靈敏度欠佳;高效液相色譜法準確，但所需儀器昂貴，樣品預處理復雜。為此，筆者建立了荷移－同步熒光光譜法直接測定血清中阿米卡星的含量，現報道如下。

1 儀器與試藥

RF－5301 PC型熒光光度計(日本島津公司);電子天平(德國Sartorius公司);HH－S型數顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市醫療儀器廠);80－2型離心沉淀器(江蘇省金壇市醫療儀器廠)。阿米卡星標準品(中國藥品生物制品檢定所);2，3－二氯－5，6－二氰基－1，4－苯醌(DDQ，美國Sigma公司);血清(鎮江中心血站);甲醇、乙腈(國藥集團化學試劑有限公司)為分析純，水為雙蒸水。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

準確稱取0.058 5 g阿米卡星標準品，用雙蒸水溶解后轉移至100 mL容量瓶中，定容制成1.00×10－3mol/L的阿米卡星標準品溶液，置4℃冰箱中保存，使用時用水逐級稀釋至所需濃度。準確稱取0.045 4 g DDQ，用甲醇溶解后轉移至100 mL容量瓶中，定容制成2×10－3mol/L的DDQ標準液，置4℃冰箱中保存，使用時用甲醇逐級稀釋至所需濃度。吸取適量阿米卡星溶液，置10 mL容量瓶中，加1 mL DDQ甲醇溶液，用甲醇定容至刻度，搖勻，置30℃水浴中恒溫30 min，取出冷卻至室溫，以364 nm為激發波長，在452 nm波長處測定荷移反應產物的熒光強度，同時做空白試驗。

2.2 測定條件選擇

2.2.1 激發波長與發射波長

按2.1項下方法配制溶液，分別對所得荷移反應產物、阿米卡星和空白試劑進行熒光激發和發射掃描，結果見圖1。在水溶液中阿米卡星能發射微弱熒光，其最大激發波長和最大發射波長分別為323 nm和366 nm。與DDQ發生荷移反應后，荷移反應產物的熒光激發峰和發射峰分別紅移至361 nm和452 nm波長處，與阿米卡星相比，其激發光譜和發射光譜分別紅移38 nm和86 nm，且熒光強度顯著增強(激發光譜和發射光譜通帶為5 nm)。

圖1 熒光激發和發射掃描圖譜

2.2.2 反應溫度

分別依法測定20～60℃水浴中阿米卡星與DDQ電荷轉移反應的熒光強度。結果從20℃起，熒光強度隨溫度的升高逐漸增強，30℃后受溫度的影響不大，故選擇30℃為反應溫度。

2.2.3 反應時間

在選定的溫度下，考察5～60 min內不同時間段的熒光光譜。結果表明，阿米卡星與DDQ在30 min后即可反應完全，故選擇反應時間為30 min。荷移反應產物在室溫下放置24 h熒光值無明顯變化，說明荷移反應產物具有較好的穩定性。

2.2.4 溶劑

在選定的反應溫度和反應時間下，分別用甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇、異丙醇、四氫呋喃進行試驗，發現阿米卡星與DDQ的荷移反應在甲醇中進行的靈敏度高，在乙醇中的熒光強度較在甲醇中低，在丙酮、正丁醇、異丙醇、四氫呋喃中無荷移反應產物生成，因此選擇反應在甲醇中進行。

2.2.5 受體及用量

為選擇合適的電子受體，分別用茜素、甲酚紅、四氯苯醌、DDQ與阿米卡星進行試驗，結果DDQ能與阿米卡星生成絡合物。DDQ用量為0.7～1.2 mL時，熒光強度最大且穩定，濃度過低則反應完全，而濃度高可導致熒光強度下降。故選擇2×10－5mol/L的DDQ 1.0 mL。

2.3 干擾試驗

在最佳試驗條件下，考察了體內常見金屬離子對阿米卡星測定的干擾情況。結果在相對誤差不大于±5%時，250倍量的K+，200倍量的 Ca2+，100倍量的 Na+，5倍量的 Al3+，2倍量的 Mg2+，0.5 倍量的 Fe3+，20 倍量的 Zn2+，0.05 倍量的 Cu2+等不干擾測定。

2.4 阿米卡星回收率測定

2.4.1 血清處理

取血清30 mL，加乙腈30 mL，混合，在3 000 r/min轉速下離心處理10 min，待蛋白質沉淀后取上清液，置冰箱中保存。

2.4.2 測定方法

準確移取1 mL血清，加適量阿米卡星標準品溶液，置100 mL容量瓶中，用雙蒸水稀釋至刻度，備用。準確取1 mL備用溶液，置10 mL容量瓶中，加1 mL DDQ甲醇溶液(2×10－5mol/L)，用甲醇定容至刻度，搖勻，于30℃水浴中恒溫30 min，取出冷卻至室溫，在 Δλ=30 nm，狹縫寬度為5 nm時測熒光強度，同時做試劑空白試驗。

分別對阿米卡星與DDQ的荷移反應產物和空白血清做熒光光譜掃描(圖2)，由圖2可見，測定血清中阿米卡星時，由于血清中內源性熒光物質的背景干擾，常規熒光分析方法難以測定。而同步熒光光譜法能很好地解決這個問題，在同步熒光光譜測定中，Δλ是最重要的參數，直接影響方法的靈敏度和選擇性。分別在 Δλ為20，30，40，50，60，70，80 nm 時，對含有阿米卡星的血清做同步熒光光譜掃描。結果表明，Δλ=30 nm時，阿米卡星荷移反應產物與血清中的內源性熒光物質分辨率最好，靈敏度最高(圖3)。

圖2 熒光發射波長圖譜

圖3 同步熒光發射光譜

按測定方法操作，設定 Δλ=30 nm，對不同濃度的荷移反應體系分別在310～600 nm波長范圍內進行同步熒光光譜掃描。結果表明，阿米卡星濃度在 0.3×10－6～1.5 ×10－6mol/L(即 175.65 ～878.25 μg/L)范圍內與熒光強度線性關系良好，回歸方程 F=19.692 C+132.459 3(C 為 10－6mol/L)，r=0.998 3，檢出限為33.387 μg/L。

取 1 mL 空白血清和 4 ×10－5mol/L(相當于 23.42 μg/mL)的阿米卡星標準品1mL，置100mL容量瓶中，用雙蒸水定容，搖勻。取1mL試樣溶液，置10 mL比色管中，依法做回收率試驗，結果見表1。

表1 血清中阿米卡星回收率測定結果(n=3)

3 討論

采用同步熒光技術很好地避免了血清中基體熒光與藥物熒光光譜重疊而引起的干擾，血清不須預處理即可直接測定其中阿米卡星的含量，回收率測定結果令人滿意，方法操作簡單，靈敏度高，檢出限低，體系穩定性好，損失小，對生物樣品中藥物含量的測定具有一定的理論意義和應用價值。

[1]周 蕓.曲利本藍、依文思藍與氨基糖苷類抗生素的共振瑞利散射光譜研究及分析應用[D].濟南:山東大學，2007.

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[5]張力增，陳 琪.分光光度法測定硫酸阿米卡星注射液的含量[J].海峽藥學，2003，15(5):52－53.

[7]張 萍.熒光光譜法測定阿米卡星含量[J].化學工程師，2007(1):30－31.

[8]張遠馥，王金中，郝巧艷.共振瑞利散射法測定阿米卡星[J].南陽師范學院學報，2008，7(3):49－52.