花椒多酚類化合物對慢性應激抑郁大鼠的治療作用機制研究

周 皎 ，木海鷗 ，王 瑋

(1.浙江省溫州市第三人民醫院，浙江 溫州 325000; 2.溫州醫學院附屬第二醫院，浙江 溫州 325027)

抑郁癥是一種情感障礙性精神疾病，其終生患病率為5.2% ～16.2%，女性高達25%[1]。抑郁癥的發生機制涉及到交感神經系統、內分泌系統和免疫系統等多個方面[2]。慢性應激較好地模擬了人類抑郁樣癥狀，其主要特征為機體受到內外環境刺激后發生下丘腦－垂體－腎上腺軸功能失調及免疫系統功能紊亂，由此引發各種行為和功能的改變[3－4]。花椒多酚類化合物(ZPPC)為蕓香科植物青椒 Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc.或花椒 Zanthoxylum bungeanum Maxim.的干燥成熟果皮，具有溫中止痛、驅蟲、外用燥濕、殺蟲止癢的功效[5]，主要化學成分為生物堿、酰胺、木脂素、香豆素、揮發油和脂肪酸等。筆者以四川漢源花椒為研究對象，研究了花椒總多酚類化合物的抗抑郁作用，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

動物:雄性SD大鼠，二級，體重200～220 g。飼養條件為每籠4只，溫度(24±1)℃，相對濕度(50±10)%，自然光照，晝夜節律，自由攝食飲水。所有動物適應環境3 d后開始試驗，試驗前禁食10 h，飲水自由。

試藥:花椒購自四川九襄;粉碎后用丙酮－水溶液(7∶3)浸提，減壓除去浸提液中丙酮，然后過濾殘留水液，將濾液經醋酸乙酯萃取分離，脫水干燥，得到ZPPC總粗提取物(得率為0.033%)，為黃棕色粉末，試驗前用雙蒸水配成所需濃度。丙咪嗪、皮質酮和白細胞介素1β(IL－1β)酶聯免疫吸附試劑盒均購自美國RD公司。其他常規試劑均為分析純。

儀器:DigBehv動物行為分析系統(上海吉量軟件科技有限公司);BS110S型分析天平(北京賽多利斯儀器公司);醫用離心機(金壇市醫療器械廠);DMSL型輪轉式切片機(金華科迪儀器設備有限公司);550型全自動酶標儀(美國Bio－Rad公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠慢性應激模型的建立與分組

按文獻[6]方法制作大鼠模型。每日測定體重，按體重連續給藥21 d，第21天進行行為測試，斷頭殺鼠。將40只慢性應激模型大鼠隨機均分為5組，即應激模型組，低、中、高劑量ZPPC組和丙咪嗪組。低、中、高劑量ZPPC組分別于測試前60 min按體重灌胃給予50，100，200 mg/kg的ZPPC;丙咪嗪組于測試前30 min按體重腹腔注射以雙蒸水溶解為10 mg/kg的丙咪嗪。另取8只正常大鼠，設為正常對照組，正常對照組和應激模型組均灌胃給予等體積雙蒸水。

1.2.2 開野試驗[7]

在給予慢性應激21 d后，各組大鼠均開始本試驗。正方形開野實驗箱為80 cm×80 cm×75 cm，底板用筆畫成10 cm×10 cm的方格，其正上方距離底板90 cm高處放一只60 W白熾燈泡。將大鼠放于開野箱中央測試10 min，觀察后5 min內大鼠的活動情況，包括自主活動次數(方格間穿行次數)、豎起及探究次數(兩前肢離地1 cm以上的次數)。

1.2.3 大鼠強迫游泳試驗[8]

在連續給予ZPPC 14 d后進行試驗。正式測試前24 h，將大鼠置水深23 cm的玻璃圓缸(高 40 cm，直徑 18 cm)內，水溫(24±1)℃，作強迫游泳訓練15 min。在末次給藥后60 min(ZPPC，灌胃給藥)或30 min(丙咪嗪，腹腔注射給藥)，再次將大鼠置水深23 cm的玻璃圓缸內強迫游泳5 min，觀察并記錄5 min內大鼠的不動時間。當大鼠停止掙扎，浮在水中保持不動，或僅做一些必要的輕微動作保持頭部浮在水面上的時間視為不動時間。

1.2.4 血清皮質酮和IL－1β水平測定

取全血5～10 mL，室溫放置20 min后以1 000 r/min轉速離心10 min，分離血清，－20℃凍存備用。用酶聯免疫吸附試驗雙抗體夾心法測定大鼠血清中皮質酮和IL－1β的含量，嚴格按照試劑盒使用說明操作。

1.2.5 腎上腺皮質厚度測定

大鼠處死后摘取腎上腺，放入10%甲醛溶液固定，經脫水、透明、包埋后切片，HE染色鏡檢、照相。采用圖像分析軟件測定腎上腺皮質厚度。

1.3 統計學方法

采用SPSS 13.0統計軟件包進行統計學處理，數據以均數±標準誤(±s)表示，藥物作用以單向方差分析方法進行分析，組間差異(P ＜0.05)采用 Dunnett’s t檢驗。

2 結果

2.1 對開野箱中活動性的影響

如表1所示，與正常大鼠相比，慢性應激模型大鼠爬行格數、豎立及探究次數均明顯減少(P＜0.001);而在給予不同劑量(50，100，200 mg/kg)ZPPC后，應激大鼠行為明顯改善，爬行格數、豎立及探究次數均出現不同程度的增加。

表1 ZPPC對慢性應激大鼠活動性的影響(± s，n=8)

表1 ZPPC對慢性應激大鼠活動性的影響(± s，n=8)

注:與正常對照組比較，#P＜0.001;與應激模型組比較，＊P＜0.01，▲P ＜0.001。

正常對照組應激模型組低劑量ZPPC組中劑量ZPPC組高劑量ZPPC組丙咪嗪組50 100 200 10 54.4 ±8.8 26.1 ±7.6#32.8 ±4.5＊41.0 ±4.8▲52.9 ±5.2▲4.3 ±0.7▲20.0 ± 3.5 7.1 ± 4.0#11.1 ± 4.0＊15.6 ± 3.4▲20.3 ± 2.9▲4.6 ± 0.8＊

2.2 對強迫游泳不動時間的影響

與正常大鼠相比，慢性應激模型大鼠在強迫游泳中的不動時間大幅增加，差異有顯著性(P＜0.001);ZPPC能劑量依賴性地減少應激大鼠的強迫游泳不動時間(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001)。結果見圖1。

圖1 ZPPC對慢性應激大鼠強迫游泳不動時間的影響(± s，n=8)

2.3 對腎上腺皮質厚度及血清皮質酮水平的影響

與正常大鼠相比，應激大鼠腎上腺皮質厚度明顯增加(P＜0.001)，而給藥組大鼠的腎上腺皮質厚度較應激模型組均有所減少(P＜0.01)。同時，應激模型組大鼠血清皮質酮含量明顯高于正常對照組大鼠(P＜0.001)，各給藥組皮質酮含量明顯下降，與應激模型組相比差異有顯著性(P ＜0.05，P ＜0.01，P ＜0.001)。結果見表 2。

表2 ZPPC對慢性應激大鼠腎上腺皮質厚度和血清皮質酮質量濃度的影響(± s，n=8)

表2 ZPPC對慢性應激大鼠腎上腺皮質厚度和血清皮質酮質量濃度的影響(± s，n=8)

注:與正常對照組比較，#P＜0.001;與應激模型組比較，＊P＜0.05，△P ＜0.01，▲P ＜0.001。

組別正常對照組應激模型組低劑量ZPPC組中劑量ZPPC組高劑量ZPPC組丙咪嗪組劑量(mg/kg)50 100 200 10腎上腺皮質厚度(μm)693.1 ± 5.8 959.6 ± 3.7#756.6 ±6.2△725.3 ±6.0△715.4 ±3.6△699.3 ±9.0▲皮質酮質量濃度(ng/mL)64.4 ±9.3 101.1 ±6.9#93.5 ±10.3＊83.5 ±6.7△75.4 ±4.5▲70.1 ±7.8▲

2.4 對血清IL－1β水平的影響

如圖2所示，應激模型組大鼠血清IL－1β水平顯著高于正常對照組(P＜0.001)，50，100，200 mg/kg ZPPC 組和丙咪嗪 10 mg/kg組對慢性應激所致IL－1β水平上升具有明顯的抑制作用，與應激模型組相比差異有顯著性(P ＜0.05，P ＜0.01，P ＜0.001)。

圖2 ZPPC對慢性應激大鼠血清IL－1β水平的影響(± s，n=8)

3 討論

抑郁癥的病因尚不能徹底闡明，目前認為長期慢性、低水平的應激源是促進抑郁發生、發展的主要原因。慢性不可預知性大鼠應激模型就是根據此理論建立的，其特點是應激因子的多變性和不可預知性，這一模型已成為國內外學者探討抑郁癥發病機制和抗抑郁藥作用機理時廣泛應用的動物模型[9]。

本試驗中大鼠經21 d的慢性綜合性應激后，在開野試驗中5 min內的爬行格數和探究次數明顯減少，說明應激模型組大鼠活動能力下降、緊張程度增加且興趣喪失;本試驗用經典的大鼠強迫游泳試驗來反映大鼠對絕望的反應程度，游泳不動時間增加提示大鼠對環境的絕望增加。而在給予慢性應激大鼠不同劑量(50，100，200 mg/kg)ZPPC灌胃治療后，大鼠活動性增強，對外周環境的探究興趣增加，在強迫游泳中的絕望不動時間也減少，提示ZPPC可以顯著改善應激大鼠的抑郁癥狀，增加抑郁大鼠的活動性及對絕望的抵抗能力。

越來越多的研究顯示[10]，神經－內分泌－免疫系統之間存在著復雜的相互關系，免疫功能低下是抑郁癥的特征之一。ZPPC和經典抗抑郁藥丙咪嗪不僅能逆轉應激抑郁大鼠行為表現的異常，對抑郁大鼠腎上腺出現的病理改變，如皮質增生、肥厚等也有明顯改善作用。本試驗中慢性應激模型大鼠血清IL－1β水平顯著升高，說明抑郁大鼠的免疫功能低下。給予ZPPC治療后該水平顯著下降，提示ZPPC很可能還通過改善免疫功能而減輕抑郁癥狀。總之，ZPPC可以改善慢性應激導致的腎上腺結構和功能的失衡，調整免疫和內分泌系統的功能，從而具有抗抑郁效果。

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