注射用氨磷汀安全性研究

(河南省食品藥品檢驗所，河南 鄭州 450003)

注射用氨磷汀是一種有機硫化磷酸化合物，在組織中被與細胞膜結合的堿性磷酸酶水解脫磷酸后成為具有活性的代謝產物WR－1065，所含巰基具有清除組織中自由基的作用，能降低順鉑、環磷酰胺、絲裂霉素等藥物的毒性[1]，故筆者根據藥物分類及注射劑研制要求，結合注射劑安全性試驗指導原則，對注射用氨磷汀做了安全性試驗，現報道如下。

1 材料

1.1 藥物和試劑

注射用氨磷汀(批號為20090301，規格為0.4 g/瓶，河南省大明制藥有限公司);氯化鈉注射液(批號為090212211，鄭州永和制藥有限公司);牛血清白蛋白(批號為32093239，北京索萊寶科技有限公司);依文思藍(批號為87－04－01，上海化學試劑采購供應站分裝廠進口分裝);甲醛(天津市化學試劑三廠)。

1.2 動物

豚鼠，普通級，體重300～400 g(雌雄不拘)，購自北京沙河通利試驗動物養殖場，許可證號為SCXK(京)2005－0003;SD大鼠，清潔級，體重180～220 g(雌雄各半)，購自河南省實驗動物中心，許可證號為SCXK(豫)2005－0001;日本大耳白家兔，普通級，體重2.0～3.0 kg(雌雄不拘)，購自河南省康達實驗動物有限公司，許可證號為SCXK(豫)2005－0002。雌雄動物分籠飼養，自由飲水。環境溫度(23±2)℃，相對濕度50% ～65%，12 h光照明暗交替，通風良好。

1.3 儀器

CP225D型電子天平(德國Sartorius公司);PB4002－S型電子天平(瑞士Mettler Toledo儀器有限公司);SF2000型三按鍵電子數顯卡尺(桂林廣陸數字測控股份有限公司);RTZ－10A－RT型嬰兒秤(無錫市衡器廠);DR－HW－1型電熱恒溫水溫箱(北京西城區醫療器械廠);CH30型顯微鏡(日本Olympus公司)。

2 方法與結果

2.1 全身主動過敏性試驗(ASA)

取健康豚鼠24只，隨機分為4組(每組6只):陰性對照組給予0.9%氯化鈉注射液;陽性對照組給予0.5%牛血清白蛋白;注射用氨磷汀高劑量組給予注射用氨磷汀，致敏劑量為163 mg/kg，激發劑量為326 mg/kg;注射用氨磷汀低劑量組給予注射用氨磷汀，致敏劑量為81 mg/kg，激發劑量為163 mg/kg;給藥質量濃度均為57 g/L。隔日每只每次腹腔注射注射用氨磷汀0.5 mL(高劑量組致敏容積為1.0 mL)，共3次，進行致敏，然后各組再分為2組，每組3只，分別在首次注射后第14日和第21日由耳緣靜脈注射注射用氨磷汀1.0 mL進行攻擊(高劑量組激發容積為2.0 mL)。每日觀察動物的癥狀，靜脈注射后30 min內觀察每只動物的癥狀反應，根據過敏反應發生率和發生程度進行綜合判斷[2－4]。結果陽性對照組6只豚鼠均出現過敏反應，為極強陽性(++++);陰性對照組和注射用氨磷汀高、低劑量組豚鼠均未出現過敏反應。

2.2 被動皮膚過敏性試驗(PCA)

抗體制備:取大鼠8只，隨機分為4組(每組2只):陰性對照組給予0.9%氯化鈉注射液;陽性對照組給予1%牛血清白蛋白;注射用氨磷汀高劑量組給予注射用氨磷汀，給藥質量濃度為20 g/L，致敏劑量為200 mg/kg;注射用氨磷汀低劑量組給予注射用氨磷汀，給藥質量濃度為10 g/L，致敏劑量為100 mg/kg(均以0.9%氯化鈉注射液復溶)。隔日每只每次腹腔注射注射用氨磷汀每100 g體重1.0 mL/100 g，共3次，進行致敏。末次致敏后10 d采血，以2 000 r/min轉速離心處理10 min，分離血清，合并每組大鼠血清，分別制得混合抗血清，－20℃保存，2周內備用。

試驗方法:取大鼠24只，隨機分為4組(每組6只)，分組及給藥方法同抗體制備項下方法。試驗前，動物背部脫毛3 cm×4 cm，然后皮內注射各對應組的抗血清0.1 mL(抗血清的稀釋度為1∶2)，進行被動致敏。48 h后分別在各組尾靜脈注射含1%依文思藍的對應供試品，給藥容積均為每100 g體重0.5 mL。30 min后脫臼處死各組動物，剪取背部皮膚，測量皮膚內層藍色反應斑的直徑，并進行比較。

結果:陽性對照組大鼠藍斑直徑大于5 mm，為(6.63±1.66)mm，呈陽性;高劑量組為(1.06±1.66)mm，陰性對照組和注射用氨磷汀低劑量組大鼠藍斑直徑小于5 mm，呈陰性。

2.3 體外溶血試驗

2%紅細胞懸液配制:取健康家兔1只，自心臟取血10 mL左右，放入含玻璃珠的干燥三角燒瓶中，振搖10 min，除去纖維蛋白原，使成脫纖血液。將去纖維蛋白血移入刻度離心管內，加5%葡萄糖注射液約10倍量，搖勻，以1 500 r/min轉速離心處理15 min，傾去上清液，沉淀的紅細胞再用5%葡萄糖注射液按上述方法洗滌2～3次，至上清液不顯紅色為止。將所得紅細胞按其容積用5%葡萄糖注射液配成2%的混懸液。

試驗方法:取潔凈試管7支，編號，1號至5號管為供試品管，6號管為陰性對照管，7號管為陽性對照管。按表1依次加2%紅細胞懸液、5%葡萄糖注射液、純化水、受試藥物，混勻后立即置(37±0.5)℃的水浴鍋內溫育。開始每隔15 min觀察1次，1 h后，每隔1 h觀察1次，最長觀察3 h。

結果:陽性對照管有溶血發生，溶液呈澄明紅色，管底幾無紅細胞殘留;陰性對照管和注射用氨磷汀各管均無溶血和凝聚發生，紅細胞全部下沉，上清液無色澄明。顯微鏡下觀察，陰性對照管和注射用氨磷汀各管紅細胞形態正常。

表1 體外溶血試驗加藥方法

2.4 血管刺激性試驗

取健康家兔4只，采用同體左右側自身對比法，于左側耳緣靜脈注射0.9%氯化鈉注射液，右側耳緣靜脈緩緩注射氨磷汀40 mg/kg，給藥質量濃度為20 g/L，給藥容積均為2.0 mL/kg，1天1次，連續5 d。每天給藥前及末次給藥后48，72，96 h對動物和注射部位進行肉眼觀察，觀察期結束時，取2只動物的耳緣靜脈近心端血管2～3 cm供病理組織學檢查，留下的2只動物繼續觀察14 d再進行病理組織學檢查，以了解刺激性反應的可逆程度。在規定的時間內觀察，結果家兔雙側耳未見明顯充血水腫，血管均正常。病理組織學檢查顯示，給藥結束時左耳鱗狀上皮無增生、萎縮、上皮下無充血、水腫及炎癥。恢復14 d后各動物左右耳均未見血管擴張和炎細胞浸潤，提示本品對家兔血管無刺激性。

3 討論

注射藥物的安全性評價是藥物臨床前試驗研究的一個重要組成部分，主要由過敏性試驗、體外溶血試驗、血管刺激性試驗等組成，其試驗方法和評定標準可參照2005年國家食品藥品監督管理局《化學藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則》。

本試驗受試藥物劑量依據注射用氨磷汀使用說明書，用于化學治療患者最大劑量，按體表面積一次600 mg/m2，溶于0.9%氯化鈉注射液50 mL中靜脈滴注。計算的人用劑量為16.2 mg/kg(按60 kg體重計)，折算成動物等效劑量。在預試驗給予此劑量未發生毒性反應的原則下，將此劑量設為受試物低劑量的致敏劑量，受試物高劑量則給予低劑量的數倍量，本試驗設定的高劑量為低劑量的2倍量，激發劑量一般為致敏劑量的2～5倍。

試驗結果顯示，注射用氨磷汀對紅細胞未見溶血和凝聚作用，全身主動過敏試驗及被動皮膚過敏性試驗均未見過敏反應，家兔靜脈注射給藥后未見血管刺激性，說明本品安全性良好，可靜脈注射給藥。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].北京:化學工業出版社，2005:附錄ⅪK.

[2]陳 奇.中藥藥理研究方法學[M].第2版.北京:人民衛生出版社，2006:157.

[3]徐叔云，卞如廉，陳 修.藥理實驗方法學[M].第3版.北京:人民衛生出版社，2002:237.

[4]袁伯俊，王治喬.新藥臨床前安全性評價與實踐[M].北京:軍事醫學科學出版社，1997:46.