克霉唑乳膏微生物限度檢查方法學研究＊

(重慶市藥品檢驗所，重慶 401121)

克霉唑乳膏屬抗真菌藥，臨床用于治療各種皮膚癬、念珠菌性甲溝炎和念珠菌性外陰陰道炎。該藥全國現有批準文號8個，涉及6個生產廠家和2個規格，2個規格分別為1%和3%，但市場上抽到的卻有幾十家生產企業的該藥產品。查詢國家食品藥品監督管理局相關網站數據庫資料，發現目前許多上市銷售的克霉唑乳膏，根據其批準文號溯源查詢，其產品名稱均為克霉唑軟膏。而克霉唑軟膏的批準文號共有98個，因此使得該樣品所用基質存在較大差異。為此，筆者對各藥品說明書中所列出的輔料進行比較，選出了幾個有代表性的樣品，并對其微生物限度檢查方法學進行了研究，現報道如下。

1 材料與儀器

1.1 樣品與培養基

克霉唑乳膏:江西杏林白馬藥業有限公司(規格為1%，批號為20071201);新鄉市琦寧藥業有限公司(規格為1%，批號為20080301，20080305);廣東順峰藥業有限公司(規格為3%，批號為20080101);重慶科瑞制藥有限責任公司(規格為3%，批號為070909);北京雙吉制藥有限公司(規格為3%，批號為080454);青島國風維奧制藥有限公司(規格為3%，批號為080201);楊凌生物醫藥科技股份有限公司(規格為3%，批號為20080101);天津藥業集團有限公司(規格為1%，批號為0802032)。共8個廠家9個批次的樣品。營養肉湯培養基(批號為080710)、營養瓊脂培養基(批號為080821)、改良馬丁培養基(批號為080617)、玫瑰紅鈉瓊脂培養基(批號為080626)、卵黃氯化鈉瓊脂培養基(批號為080716)、甘露醇氯化鈉瓊脂培養基(批號為080919)、膽鹽乳糖培養基(批號為090203)、十六烷基三甲銨瓊脂培養基(批號為081021)，均由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.2 試驗菌株

金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、生孢梭菌[CMCC(B)64941]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]，均由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.3 儀器

全封閉薄膜過濾器，由杭州泰林生物技術設備有限公司提供。

2 方法與結果

2.1 菌液制備

接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中，接種生孢梭菌的新鮮培養物至硫乙醇酸鹽流體培養基中，30～35℃培養24 h;接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中，23～28℃培養48 h上述培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 mL含菌數小于100 CFU的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基上，23～28℃培養7 d，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 mL含孢子數小于100 CFU的孢子懸液。菌懸液每次試驗前新鮮配制，備用。

2.2 細菌、霉菌和酵母菌檢查方法學考察

2.2.1 普通直接接種法

首先采用pH=7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液將克霉唑乳膏分散后，制成1∶10的供試液;取供試液1 mL和2.1項下制備的試驗菌菌懸液1 mL，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備兩皿，按平皿法測定其菌數;另同法測定所加的試驗菌數。結果菌回收率金黃色葡萄球菌為38%，大腸埃希菌為55%，枯草芽孢桿菌為23%，白色念珠菌為0，黑曲霉為1%，說明克霉唑乳膏對細菌、霉菌和酵母菌均有一定的抑制作用。

2.2.2 培養基稀釋法

根據2.2.1項的試驗結果對試驗方法進行了調整，采用培養基稀釋法進行試驗。每1 mL供試液(1∶10稀釋液)等量分注5皿，每皿加供試液0.2 mL，進行回收率試驗。結果菌回收率金黃色葡萄球菌為65%，大腸埃希菌為73%，枯草桿菌為48%，白色念珠菌為2%、黑曲霉為10%，說明培養基稀釋法能夠較好地去除克霉唑乳膏對大腸埃希菌的抑菌作用，但對其他菌仍有一定的抑菌作用。

2.2.3 薄膜過濾法

稀釋液選擇:由于培養基稀釋法不能很好地去除樣品的抑菌作用，故決定采用薄膜過濾法對樣品進行處理后進行細菌、霉菌和酵母菌計數檢查。因薄膜過濾法需考慮樣品在稀釋劑中的分散效果以及過濾情況，故對其分散劑進行了系統考察。分別選擇pH=7.0的無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液、十四烷酸異丙酯作為稀釋劑，以及先加入吐溫80乳化后再加入緩沖液分散的方法進行試驗。結果樣品于十四烷酸異丙酯中不能分散，加吐溫80進行乳化后分散效果改善不明顯，意義不大。經摸索比較，最終確定的樣品分散方法為，取克霉唑乳膏10 g，加恒溫(45℃)的pH=7.0的無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液至100 mL

沖洗量選擇:由于克霉唑不溶于水，為考察樣品過濾后克霉唑是否還對霉菌及酵母菌計數產生影響，先取樣品10 g，加恒溫至45℃的pH=7.0的無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液至100 mL，直接過濾而不進行沖洗，以白色念珠菌作為試驗菌并延長觀察時間。結果樣品陽性組生長較陽性對照組緩慢，但在第5天回收率可達38%，較其他方法回收率有明顯提高，顯示薄膜過濾應該能去除樣品中克霉唑的影響，若進行沖洗，則能更好地去除樣品中克霉唑的影響。分別采用200，500，800 mL的沖洗量對各陽性試驗菌的回收率進行測定，結果見表1。

表1 薄膜過濾法沖洗量選擇回收率試驗結果

試驗結果:以金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉作為試驗菌，對薄膜過濾后沖洗800 mL的方法進行了確認試驗。結果試驗菌回收率金黃色葡萄球菌為82%，大腸埃希菌為88%，枯草芽孢桿菌79%，白色念珠菌80%，黑曲霉87%，回收率均大于70%，符合藥典相關要求。

2.3 控制菌檢查方法學考察

采用常規方法，直接將供試液10 mL加入100 mL增菌培養基中，以金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌作為陽性菌，大腸埃希菌為陰性對照菌，依法進行檢查。結果加入樣品后的金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌均于48～72 h方可檢出，陽性對照菌于24 h生長良好，陰性對照菌未檢出大腸埃希菌，顯示樣品對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌有輕微的抑菌作用。

采用培養基稀釋法，每10 mL(1∶10)供試液加入不少于200 mL培養基中，金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌均于24 h內檢出，陽性對照菌于24 h生長良好，陰性菌對照組未檢出大腸埃希菌。因此，該方法能夠去除樣品中的抑菌物質對控制菌檢查的影響。

2.4 方法確認

由于各生產廠家的產品處方工藝均存在一定的差別，故采用8個廠家各1批樣品對2.2項和2.3項下確定的方法進行了確認，細菌、霉菌和酵母菌計數采用將供試液薄膜過濾、沖洗800 mL的方法進行檢查。結果表2。可見，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉回收率均大于70%。

表2 各生產廠家產品細菌、霉菌和酵母菌回收率試驗結果(%)

控制菌檢查采用培養基稀釋法，每10 mL(1∶10)供試液加入不少于200 mL的增菌培養基中，結果8個生產廠家的樣品試驗組金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌均于24 h內檢出，陰性菌對照組均未長菌。

2.5 樣品微生物限度檢查方法

取本品10 g，加恒溫至45℃的pH=7.0的無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液至100 mL，均勻分散后，制成1∶10的供試液。取1 mL供試液，薄膜過濾，再用800 mL pH=7.0的無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液分次沖洗濾膜，取出濾膜，菌面朝上貼于營養瓊脂培養基或玫瑰紅鈉瓊脂培養基平板上培養，進行細菌、霉菌和酵母菌數計數檢查;另取10 mL供試液，加入不少于200 mL的亞碲酸鈉(鉀)肉湯(或營養肉湯)培養基和膽鹽乳糖培養基中，依法[1]進行金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的控制菌檢查，應符合規定。

3 討論

從各生產企業產品所附藥品說明書處方來看，處方中除含具有抗真菌作用的主藥克霉唑外，還含有羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、苯甲酸鈉、醋酸氯己定等防腐劑，故該藥對細菌也具有一定的抑菌作用，與試驗結果相吻合。

由于乳膏劑呈黏稠狀態，即使分散后過濾也較困難，且克霉唑本身幾乎不溶于水。為此，曾嘗試采用無菌十四烷酸異丙酯分散后，再以氯化鈉－蛋白胨緩沖液萃取的方法除去脂溶性的抑菌成分，但該乳膏劑在十四烷酸異丙酯中不能很好分散，方法不可行。

雖然克霉唑本身幾乎不溶于水，但采用較好的分散劑分散，大量的氯化鈉－蛋白胨緩沖液沖洗后，還是可將其殘留在薄膜上的抑菌成的除去，從而順利地進行微生物檢查。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].北京:化學工業出版社，2005:附錄ⅪJ.