杜仲總黃酮的提取工藝優(yōu)化

(湖南省張家界市藥品檢驗(yàn)所，湖南 張家界 427000)

杜仲為杜仲科杜仲屬植物，俗稱(chēng)木棉、絲連皮等，原產(chǎn)于我國(guó)，在日本、朝鮮、緬甸亦有栽培。現(xiàn)代藥理研究表明，杜仲含有綠原酸、桃葉珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、黃酮類(lèi)物質(zhì)、地普黃內(nèi)酯、多糖等活性成分，具有補(bǔ)肝腎、堅(jiān)筋骨、降壓、抗菌、利尿、抗腫瘤、久服輕身耐老之功效。由于杜仲獨(dú)特的藥用價(jià)值和潛在的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其化學(xué)成分和生物活性作了大量的研究[1]。黃酮類(lèi)化合物具有降血糖、調(diào)血脂、抗菌消炎、抗氧化、抗衰老、消除體內(nèi)自由基等藥理作用[2]，因此經(jīng)濟(jì)、高效的黃酮提取工藝極其重要。微波是一種超高速電磁波，具有很強(qiáng)的穿透作用，能使植物細(xì)胞中的水分或有機(jī)溶劑迅速升溫升壓，使細(xì)胞壁穿孔，讓有效成分從細(xì)胞中溶出，而且微波電磁場(chǎng)能使分子運(yùn)動(dòng)短時(shí)間內(nèi)加劇，從而縮短了提取時(shí)間，提高了提取率[3]。本試驗(yàn)通過(guò)比較回流提取法、超聲提取法、微波提取法對(duì)黃酮提取率的影響，采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選黃酮的最佳提取工藝。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與材料

TU－1901型紫外分光光度計(jì)(北京惠普通用儀器公司);AUW220D型電子分析天平(日本島津公司);格蘭仕WD800G型微波爐(佛山市順德微波爐電器有限公司);KQ2200型超聲波清洗機(jī)(昆山超聲儀器公司);HHS－2S型電熱恒溫水浴鍋(上海南陽(yáng)儀器有限公司);QE－500型搖擺式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(浙江省武義縣屹立工具有限公司)。杜仲(市售品);蘆丁對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所);試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮含量測(cè)定方法(紫外分光光度法)

2.1.1 方法學(xué)考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:精密稱(chēng)取干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品10 mg，用75%乙醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，混勻。精密吸取此液0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL，分別置 10 mL 容量瓶中，各加 5% 亞硝酸鈉 0.3 mL，放置 6 min，再加硝酸鋁 0.3 mL，放置 6 min，加 4% 氫氧化鈉溶液2 mL，以75%乙醇稀釋至刻度，搖勻。在510 nm波長(zhǎng)處，以空白試劑為參比測(cè)定吸光度，回歸方程為 A=11.70 C－0.004 4，r2=0.999 4(n=6)。結(jié)果表明，蘆丁對(duì)照品質(zhì)量濃度在0.005～0.025 g/L范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn):取對(duì)照品溶液(0.010 2 g/L)，依法連續(xù)測(cè)定5次。結(jié)果的 RSD為0.35%(n=5)，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn):精密稱(chēng)取同一樣品10 g，共5份，依法測(cè)定含量。結(jié)果的 RSD為0.31%(n=5)，表明方法重復(fù)性較好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液，分別于配制后0，15，30，45，60 min時(shí)依法測(cè)定。結(jié)果吸光度的 RSD為0.88%(n=5)，表明供試品溶液在60 min內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn):精密取蘆丁對(duì)照品溶液(0.102 18 g/L)1.0 mL，加入到杜仲提取液中做回收試驗(yàn)，重復(fù)3次。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 蘆丁加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

2.1.2 樣品含量測(cè)定

取一定量樣品的提取液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制項(xiàng)下方法處理，分別用分光光度計(jì)在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，代入回歸方程，計(jì)算得總黃酮含量。

2.2 杜仲黃酮提取方法確定

稱(chēng)取杜仲粉末10 g(過(guò)60目篩)，分別采用回流提取法(加60%乙醇200 mL，水浴回流60 min，過(guò)濾，提取2次，合并濾液，定容至100 mL)、超聲提取法(置500 mL錐形瓶中，加60%乙醇200 mL，室溫下超聲提取60 min，過(guò)濾，濾液定容至100 mL)、微波提取法(加60%乙醇200 mL，在微波功率200 W條件下加熱提取120 s，過(guò)濾，共提取2次，合并濾液，定容至100 mL)提取，考察提取方法。結(jié)果見(jiàn)表2。從總體上比較，微波提取法的提取率最高，回流提取法次之，超聲提取法最低。回流提取法由于高溫時(shí)間長(zhǎng)，易溶出杜仲中的蛋白質(zhì)、糖類(lèi)等物質(zhì)，須進(jìn)一步提純;超聲提取時(shí)間較長(zhǎng)，功率消耗大，提取率不高。故將微波提取法作為杜仲黃酮的提取方法。

表2 杜仲黃酮提取方法考察結(jié)果比較

2.3 微波提取工藝優(yōu)化

2.3.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

微波功率主要影響升溫速度，功率越大，提取時(shí)環(huán)境溫度升得越快，相對(duì)而言，處于較高溫度的時(shí)間也越長(zhǎng)，故提取率也較高。但功率過(guò)大易使乙醇爆沸，從而導(dǎo)致?lián)]發(fā)過(guò)多;另一方面，高溫使蛋白質(zhì)凝固，黃酮不易溶出。因此，微波功率以200 W為佳[4]。通過(guò)預(yù)試驗(yàn)，選取影響杜仲黃酮提取率的主要因素乙醇體積分?jǐn)?shù)(因素 A)、提取時(shí)間 (因素 B)、料液比(因素 C)進(jìn)行 L9(34)正交試驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表3。

表3 因素水平表

2.3.2 試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)表4。直觀分析可知，微波功率為200 W時(shí)，三因素對(duì)總黃酮提取率的影響依次為A＞B＞C，即乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間＞料液比。最佳工藝條件為A1B2C2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，提取時(shí)間 10 min，料液比 1 ∶20。

表4 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3.3 工藝優(yōu)化

正交試驗(yàn)表明，影響總黃酮提取率最主要的因素是乙醇體積分?jǐn)?shù)，其次是提取時(shí)間、料液比。因素C2與C3差異較小，考慮到料液比增加，總黃酮提取率會(huì)有不同程度的增加，為提高綜合經(jīng)濟(jì)效益，將A1B2C3作為最佳提取工藝，即乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，提取時(shí)間 10 min，料液比 1 ∶30。

2.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

為進(jìn)一步考察優(yōu)選工藝的可靠性及穩(wěn)定性，取3份樣品，按最佳提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5。可見(jiàn)，該優(yōu)選工藝合理可行。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

與回流提取法、超聲提取法相比，微波提取法具有高效性、強(qiáng)選擇性、操作簡(jiǎn)便、活性成分得率高、產(chǎn)物易純化等特點(diǎn)，可廣泛用于各種中草藥中黃酮類(lèi)化合物的提取。

試驗(yàn)結(jié)果表明，杜仲總黃酮的最佳提取工藝條件為微波功率200 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，提取時(shí)間10 min，料液比1∶30(此時(shí)總黃酮得率為1.97mg/g)。

[1]孫燕榮，董俊興，吳曙光.杜仲化學(xué)成分研究[J].中藥材，2003，27(5):341.

[2]莫開(kāi)菊，程 超，黃 鵬，等.生姜黃酮提取純化及結(jié)構(gòu)的初步鑒定[J].食品科學(xué)，2005，26(9):229.

[3]仇 燕.菜芙蓉花中總黃酮微波提取的研究[J].中藥材，2006，29(4):387.

[4]陳 偉，劉青梅，楊性民，等.微波技術(shù)在杜仲黃酮提取工藝中的應(yīng)用研究[J].食品科學(xué)，2006，27(10):285.