乳腺癌淋巴管密度與血管內皮生長因子C相關性分析

許丙輝 薛亞靜 李恒力 邢宏利 杜桂梅 王樹峰

根據我國部分大城市的調查報告，乳腺癌已占女性惡性腫瘤的首位。乳腺癌發生早期轉移的途徑，主要通過淋巴系統;探討乳腺癌淋巴途徑轉移的相關因素，對于有效遏制其遠位轉移、判斷預后和選擇合適的治療方案，均具有重要臨床意義。近年來有學者研究指出，器官組織內淋巴管密度(lymphatic vessel density，LVD)，可能與腫瘤的發生和發展密切相關［1，2］。而血管內皮生長因子 C(vascular endothelial growth factor C，VEGF-C)是研究較多的特異性促淋巴管生成因子，在多種腫瘤淋巴管生成和淋巴結轉中發揮重要作用。本研究通過測定乳腺癌組織內LVD及VEGF-C的表達情況，結合手術中觀察腋窩淋巴結的癌轉移情況，探討乳腺癌組織的LVD、VEGF-C與癌轉移和預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 5例正常乳腺組織標本和5例乳腺纖維腺瘤標本均選自哈勵遜國際和平醫院外科門診手術室;40例乳腺癌組織標本選自該院2006年1月至2009年1月乳腺癌手術切除標本，均經過病理學檢查，證實為原發性乳腺癌。均為女性，年齡23～76歲，平均年齡49.50歲。所選乳腺癌病例，術前均未進行放療或化療，也未做過腫瘤活檢術或腋窩淋巴結活檢術，且都是行乳腺癌改良根治術切除的標本。其中非浸潤癌組織標本9例，浸潤性癌31例;腋窩淋巴結癌轉移17例，無淋巴結癌轉移23例。

1.2 LVD表達測定

1.2.1 取材:迅速將手術切除的乳腺組織標本剖開，切取腫瘤周邊組織(含部分腫瘤組織)1 cm×1 cm小塊，每例取6塊，迅速放入已準備好的液氮罐中，盡快送至實驗室，將組織塊作好標記，置于低溫冰箱中保存備用。

1.2.2 切片與染色:組織標本自液氮取出后，于Leika-1850型恒冷切片機的冷凍室中平衡5 min，進行連續切片，片厚5 μm，貼于防脫片處理的載玻片上。用4%多聚甲醛溶液固定15～20 min，蒸餾水清洗5 min，共3次。然后加5-核甘酸酶染色反應液，37℃條件下孵育1 h。蒸餾水清洗5 min，共3次。再用1%硫化氨顯色，顯色時間根據組織而定;蒸餾水清洗5 min，共3次。再向切片加堿性磷酸酶染色反應液，4℃條件下孵育1 h。蒸餾水清洗5 min，共3次。梯度濃度乙醇脫水(80%開始)，二甲苯透明2次后封片。

所有組織標本，均取相臨切片做HE染色。酶組織化學染色主要試劑，5’-核甘酸酶(5’-nucleotidase，5’-Nase)和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)組織化學反應試劑，均為Sigma公司產品。酶組織化學染液的配制和染色程序，參照曹雷等［3］研究報道。

1.2.3 結果判定:乳腺組織切片經5-Nase和ALP雙重組織化學染色后，淋巴管內皮由于有硫酸鉛反應產物的沉積，淋巴管呈現棕褐色。首先，在低倍(×40)顯微鏡下，觀察全切片內的淋巴管分布后，選擇淋巴管分布最為密集的六個區域;然后，在高倍(×100)顯微鏡下，觀察在熱點區每個視野下淋巴管的數目，取其均數作為該組織標本的LVD。

1.3 VEGF-C表達測定

1.3.1 試劑與方法:兔抗人VEGF-C多克隆抗體購自Santa Cruz公司。免疫組化染色SP試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，留取上述病例標本，石蠟包埋，4 μm厚連續切片，按試劑盒說明(SP法)進行操作。

1.3.2 結果判定:標準根據SHIMIZU法［4］改良而成，顯微鏡下細胞質顯示棕黃色顆粒視為陽性著色。結合著色范圍和染色強度進行半定量處理，在顯微鏡下(×200倍)隨機選取5個視野，以陽性染色細胞占視野中所有細胞的百分比均值作為著色范圍。著色范圍積分:≤1%為0分，2%～20%為1分，21%～5%為2分，≥51%為3分。著色強度積分:無著色為0分，淺著色為2分，深著色為2分。上述兩項積分表達強度積分，1.9為陰性(-)，2～2.9為弱陽性(+)，3～3.9為陽性(2+)，≥4為強陽性(3+)。

1.4 統計學分析 應用SPSS 11.5統計軟件，計量資料以ˉx±s表示，計數資料采用χ2檢驗，采用Spearman法進行相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LVD結果 酶組織化學雙重染色組織切片的光鏡觀察顯示，在乳腺癌組織的內部及其周邊部位，豐富的淋巴管呈現新生現象;淋巴管內皮呈現5’-Nase強陽性棕褐色反應，淋巴管的管壁較薄，管腔較大而且不規則;在同一張組織切片上，血管尤其是動脈血管內皮，呈現ALP強陽性藍色反應，血管的管腔較小多為圓形(圖1)。在正常乳腺組織和乳腺纖維瘤組織內，脈管樣結構則相對較少。對乳腺組織內LVD的檢測和分析表明，正常乳腺組織的LVD值為12.4±0.5，乳腺纖維瘤組織的LVD值為12.5±0.5，乳腺癌組織內的LVD值為16.1±1.5;其中，腋窩淋巴結癌轉移組乳腺癌組織的LVD值為17.7±0.5，無腋窩淋巴結癌轉移組的LVD值為14.9±0.5;二者比較差異有統計學意義(t=18.20，P=0.0001);腋窩淋巴結癌轉移組的LVD值，明顯高于無腋窩淋巴結癌轉移組。乳腺癌組織中的LVD值，明顯高于正常乳腺組織和乳腺纖維瘤組織的LVD值，二者比較差異有統計學意義(t=11.47，P=0.0001)。

圖1 乳腺癌組織切片的酶組織化學雙重染色，同時顯示血管和淋巴管(HE×100)

2.2 VEGF-C結果 VEGF-C在乳腺組織中的表達VEGF-C主要表達于乳腺癌細胞胞質中，呈現淡黃色或棕黃色顆粒，細胞膜及細胞核未見染色。40例可見乳腺癌組織中33例可見VEGF-C表達陽性，對照組僅1例可見胞質少量淡黃色顆粒。乳腺癌組織VEGF-C表達的陽性率(82.5%)明顯高于對照組(10.0%)，且差異有統計學意義(P＜0.05)。乳腺癌淋巴結轉移組VEGF-C表達陽性率(82.5%)明顯高于淋巴結無轉移組(50.3%)，且差異有統計學意義(P＜0.05)。乳腺癌組VEGF-C表達程度積分值(2.94±1.43)明顯高于對照組(0.24±0.6)，差異有統計學意義(P＜0.01)。乳腺癌淋巴結轉移組VEGF-C表達程度積分值(3.26±1.30)高于淋巴結無轉移組(2.01±1.46)，差異有統計學意義(P＜0.01)。VEGFC表達與乳腺癌淋巴結轉移呈正相關(r=0.352，P＜0.01)。2.3 相關性 LVD與VEGF-C表達呈正相關關系(r=0.786，P＜0.01)。

3 討論

VEGF-C是血管內皮生長因子家族的一員，是人類發現的第一種促淋巴管生長因子。研究認為腫瘤細胞分泌出VEGFC，經絲氨酸蛋白纖溶酶等蛋白酶作用水解，形成VEGF-C的活性形式，VEGF-C與VEGFR-3結合后迅速被磷酸化，誘導下游的信號傳導，例如激活VEGFR-3引起She磷酸化和ERK1及ERK2的活化，引起淋巴管內皮細胞增生，從而使淋巴管增生或擴張，加大腫瘤淋巴道轉移的機會。

有學者研究發現，組織內淋巴管的新生在腫瘤細胞的擴散或轉移的過程中較其他因素更為重要［5，6］。腫瘤組織內淋巴管的數量或密度與癌細胞的淋巴轉移率呈正相關。本實驗結果與這些報道或認識相一致。因此，乳腺癌組織中的LVD，可以作為預測腋窩淋巴結癌細胞轉移的重要指標之一。

本實驗研究所采用5’-Nase和ALP酶組織化學雙染方法，在同一組織切片顯示血管和淋巴管，主要是基于血管和淋巴管的內皮細胞，兩種酶的含量存在差異，特異性不強且容易受到各種因素的影響。研究表明，利用血管和淋巴管內皮存在不同的細胞因子之特點，開發針對血管和淋巴管內皮細胞因子的特異性抗體，結合應用免疫組織化學染色技術，探討正常和癌組織內脈管系的分布和LVD，并結合VEGF-C的表達研究，可能提供更為可靠的形態學證據［7］。

1 Achen MG，McColl BK，Stacker SA.Focus on lymphangiogenesis in tumor metastasis.Cancer Cell，2005，7:121-127.

2 Sleeman JP，Krishnan J，Kirkin V，et al.Markers for the lymphatic endothelium:In search of the Holy Grail.Microscopy Research and Technique，2001，55:61-69.

3 曹雷，王保芝，崔慧先，等.小鼠胰腺淋巴管的分布及其與胰島的關系.中國解剖學雜志，2006，29:184-187.

4 Shimizu M，Saitoh Y，Itoh H，et al.Immunohistochemical staiming of ha-ras oncogene produet in normal，benign，and maligant human pancreatic tissues.Human Pathol，1990，21:607-612.

5 Al-Rawi MA，Mansel RE，Jiang WG.Molecular and cellular mechanisms of lymphaniogenesis.The Journal of Cancer Surgery，2005，31:117-121.

6 Tammela T，Enholm B，Alitalo K.The biology of vascular endothelial growth factors.Cardiovascular Research，2005，65:550-563.

7 Kato S.Organ specificity of the structural organization and fine distribution of lymphatic capillary networks:Histochemical study.Histology and Histopathology，2000，15:185-197.