臍血管上血紅素氧合酶1的表達和活性與窒息新生兒的相關性研究

謝娟 張靜 程艷蕊 戎小平 張曉莉 安曉燕

充足的子宮胎盤血流灌注是胎兒健康發育的前提，己有資料證實血紅素氧合酶-1(HO-1)能增加子宮胎盤的血流灌注，加速血管生成，保護胎盤組織細胞。但是目前國內外對HO-1的研究多集中在成人疾病方面或動物實驗階段，尚未見到其與新生兒窒息發病相關性的研究報道。本研究旨在通過檢測健康足月兒及窒息新生兒臍血中HO-1的活性，并觀察HO-1在臍血管上的表達。研究探討新生兒臍血管上HO-1的表達與窒息的關系，以期進一步闡明HO-1與新生兒窒息發病的關系及相關機制，為新生兒窒息的病因學防治開辟新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集石家莊市第四醫院產科2008年1月至2009年10月正常分娩或剖宮產的新生兒60例，健康足月適于胎齡兒15例為對照組(A組)，窒息組分為輕度窒息組(B組) 30例和重度窒息組(C組)15例。其中男35例，女25例;胎齡37～42周。新生兒窒息的診斷標準參照第6版兒科學(人民衛生出版社出版)。所有新生兒均為適于胎齡兒，無宮內感染及先天畸形。母親年齡≥24歲并≤36歲，無子宮畸形及心臟病、均無吸煙史及被動吸煙史。妊娠期間無特殊用藥史。

1.2 方法

1.2.1 標本采集與制備:新生兒娩出斷臍后，立即用一次性無菌注射器從臍帶近胎兒端抽取臍靜脈血2 ml，注入潔凈的干燥試管中，待自然凝固后，以3 000 r/min離心10 min，提取血清，分裝入EP管中，置-80℃低溫冰箱中保存，用于臍血血清HO-1活性的測定;所有病例于胎盤娩出或剖出后10 min內，取近胎兒處臍帶約3 cm，用10%中性甲醛溶液固定，待脫水、石蠟包埋后用于HO-1免疫組化染色。

1.2.2 免疫組化測定:臍帶組織采用(SP)法進行免疫組化染色，石蠟標本切為5 μm厚度，每個石蠟標本預留一張切片行HE染色。HIF-1α為兔抗人多克隆抗體(購自武漢博士德公司)，HO-1山羊多克隆抗體(SC-1796)(購自美國Santa Cruz公司)。

1.2.3 血清HO-1活性測定原理:參照王虹等［1，2］，提供的血清HO的活性測定方法進行。其是依據血紅素經HO-1催化降解生成膽紅素和CO的原理，進行樣品中膽紅素生成量的測定以代表HO-1的活性。

1.2.4 結果判定:鏡下細胞胞核或胞漿出現棕黃色顆粒為陽性，每組隨機選5個高倍視野進行判斷，參照Ota等［3］組化評分標準，由兩個觀察者對切片進行盲式閱片，顯微鏡下隨機選擇5個視野，觀察所選擇的高倍鏡視野中的陽性染色細胞，記錄陽性染色細胞百分數(%)并記分。陰性:小于5%的細胞呈陽性或無著色，記0分;弱陽性:5%～10%的細胞呈陽性，記1分;陽性:11%～50%細胞呈陽性，記2分;強陽性:大于50%的細胞呈陽性，記3分。細胞著色強度則以陽性細胞呈現的染色(棕黃色)記分:無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性百分數記分和細胞染色記分相加為免疫組化積分。

1.3 統計學分析 應用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以ˉx±s表示，采用正態性檢驗和方差齊性分析，多個獨立樣本均數比較采用單因素方差分析，SNK-q法進行多個樣本均數間的多重比較，方差不齊時采用秩和檢驗分析和Spearman相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臍血管上HO-1表達 窒息組均有HO-1不同程度的表達，主要定位于臍動、靜脈血管平滑肌細胞的胞漿內，胞核內也有少量表達。B組［(3.2±0.7)分］和C組［(3.7±1.3)分］與A組［(2.1±0.8)分］比較HO-1表達強度高(P＜0.05);B組和C組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖1～4。

2.2 臍血HO-1活性 B組及C組臍血HO-1活性均顯著高于A組(P＜0.01)。而C組臍血HO-1活性測定值雖然高于B組，但差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

圖1 C組臍血管HO-1的蛋白表達(SP×100)

圖2 C組臍血管HO-1蛋白表達(SP×400)

圖3 A組臍血管HO-1蛋白表達(SP×100)

圖4 A組臍血管HO-1蛋白表達(SP×400)

表1 3組臍血中HO-1活性比較 ±s

表1 3組臍血中HO-1活性比較 ±s

注:與A組比較，*P＜0.01

組別 HO-1 F值 P值A組(n=15)62±5 B組(n=30) 89±8* C組(n=15) 93±8*94.539 ＜0.01

3 討論

新生兒窒息是指嬰兒出生后無自主呼吸或呼吸抑制而導致低氧血癥和混合性酸中毒。凡能使血氧濃度降低的任何因素都可以引起窒息，其本質是缺氧。新生兒窒息后可并發多臟器功能損害，如腦、心、腎、肝臟等損傷，國內發病率約為5%～10%，是引起新生兒死亡和兒童傷殘的重要原因之一［4］。HO-1是催化血紅素降解的起始酶和限速酶，已發現其在多種疾病中有異常表達。HO-1的內源性適量表達可以對機體起保護作用，因此本研究通過觀察窒息新生兒臍血管上HO-1的表達，及對臍血HO-1活性的測定，在分子水平探討HO-1在新生兒窒息中的作用。

HO-1及其產物CO、膽綠素和鐵均有明確的抗氧自由基作用，已被大量研究證實［5］。血紅素氧分酶(HO)是催化血紅素降解的起始酶和限速酶，具有廣泛的生物學功能，已發現有3種同工酶。其中HO-1亦稱熱應激蛋白32(HSP32)，是誘導型HO，分子量約32 000，它廣泛分布于全身組織細胞的微粒體內，在缺氧時可誘導其大量表達。體內實驗證實，在肝缺血再灌注過程中，隨著肝組織中HO-1mRNA表達的增加，肝細胞的凋亡逐漸減少。HO-1mRNA的表達增加能通過抑制細胞凋亡，減少缺血再灌注時的細胞損傷［6］。多數研究結果表明，HO-1僅在急性缺氧時升高，隨著缺氧時間的延長而逐漸降低，以至恢復。動物實驗在低灌注及低代謝狀態下，觀察到缺血3周時HO-1的表達增加，6周時HO-1蛋白表達最明顯，9周時逐漸下降，HO-1缺氧應激蛋白的基因表達，使內源性保護系統被激活，發揮代償作用［7］。Lundby等［8］觀察到，在高原地區(海拔4 100 m)居住2周和8周的健康志愿者，其肌肉組織中HO-1的表達無明顯變化。在低氧條件下培養1～2周的人肺末梢動脈平滑肌細胞，HO-1表達也無明顯變化［9］。這些結果均表明HO-1為急性應激反應蛋白。

本研究顯示，窒息組臍血管上HO-1表達明顯高于對照組，且臍血中HO-1活性測定亦高于對照組，由此推測缺氧狀態下，HO-1蛋白及酶活性的增多，對窒息時機體起到保護作用。HO-1活性測定是通過其生成膽紅素量來間接反應其活性的，因此推測在缺氧狀態下HO-1通過其代謝產物發揮抗氧化作用，保護機體對缺氧耐受。這一結果與動物實驗及成人相關研究相類似:內源性HO-1過度表達在應激情況下保護多種組織細胞，陳波等［10］通過實驗證實HIF-1能夠在轉錄水平上調節HO-1的表達，且在缺氧復氧損傷中起到顯著抗調亡作用。HO-1的代謝產物CO是一種新型神經遞質，現已證實有舒張血管，抑制血小板聚集作用。因此本實驗表明HO-1與新生兒窒息發病密切相關，在缺氧情況下表達增高，其缺氧適應性調節機制可能對機體具有重要的保護作用。

1 王虹，李華強，潘捷.哮喘豚鼠血紅素氧合酶1的表達與調節.中華結核與呼吸雜志，1999，22:605-609.

2 Yet SF，Pellacani A，Patterson C，et al.Induction of heme oxygenase-1 expression in vascular smooth muscle cell.A link to endotoxic shock.J Biol Chem，1997，272:4295-4301.

3 Ota H，Igarashi S，Sasaki M，et al.Distribution of cyclooxygenase-2 in eutopic and ectopic endo-metrium in endometriosis and adenomyosis. Hum Reprod，2001，16:561-566.

4 王翠娟.新生兒窒息的產科原因分析.河北醫藥，2010，32:1127.

5 Taille C，El-Benna J，Lanone S，et al.Induction of heme oxygenase-1 inhibits NAD(P)Hoxidase activity by down-regulating cy-tochrome b558 expression via the reduction of heme availability.J Biol Chem，2004，279:28681.

6 郭雅，宋經清，肝缺血再灌注后的表達及其與細胞凋亡關系的臨床研究.中國現代醫學雜志，2009，19:3259-3262.

7 魏愛宣，徐忠信.慢性腦缺血致認知功能障礙大鼠皮層HIF-1α、HO-1表達的變化.中國老年學雜志，2010，4:913-914.

8 Lundby C，Pilegaard H，vanHall G，et al.Oxidative DNA damage and repair in skeletalmuscle of humans exposed to high-altitude hy-poxia. Toxicol，2003，192:229-236.

9 Yang X，Sheares KK，Davie N，et al.Hypoxic induction of cox-2 regulates proliferation ofhuman pulmonary rtery smoothmuscle cells.Am J Respir Cell Mol Biol，2002，27:688-696.

10 陳波，趙鴻，鄭景存.缺氧誘導因子1在人腎微血管內皮細胞低溫缺氧再復氧損傷中的抗凋亡作用.復旦學報(醫學版)，2005，32: 687-698.