黃芪注射液對膿毒性休克大鼠循環功能的影響

楊淼 劉玉玉 李淑娟

重癥感染引發的膿毒癥及多臟器功能不全仍是目前ICU患者的主要死亡原因之一［1］。脂多糖(LPS)是存在于革蘭氏陰性菌外膜的一類物質，是內毒素的主要成分，實驗研究利用LPS可復制出經典的膿毒癥和膿毒性休克的微循環障礙模型［2］。國內俞蕾等研究發現顯示，黃芪可減慢失血性休克家兔心率(HR)，降低心肌耗氧量，改善心肌血液供應，并表明黃芪可通過改善心臟輸出功能，加速心臟收縮功能的恢復［3］。但是有關黃芪對于重癥感染及膿毒性休克的研究卻罕見報道，本實驗旨在應用LPS復制膿毒性休克大鼠模型，并應用黃芪注射液給予治療，觀察黃芪是否存在對抗膿毒性休克的作用，并對機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 藥物 LPS:O55:B5購于上海前塵生物有限公司(Sigma公司生產，美國)，用前以0.9%氯化鈉溶液溶解為10 mg/m l;黃芪注射液由哈爾濱圣泰制藥股份有限公司(批號:223020822)提供，0.8%氯化鈉溶液由北京雙鶴藥業有限公司提供(批號:20080223)，抗體:FITC-標記的抗腫瘤壞死因子-α(TNF-α)抗體，FITC-標記的抗-白介素-6(IL-6)抗體，FITC-標記的小鼠IgGk同型和FITC-標記的小鼠 IgA1同型，均購于購于BD biosciences Pharmingen(美國)。

1.2 實驗儀器 多導聯生理記錄儀(Power Lab，AD Instruments Co，Mountain View，CA，USA)流式細胞儀(FACSAria，B.D.Co，USA)

1.3 實驗動物準備 220～250 g的Wistar雄性大鼠30只由河北北方學院動物中心提供。動物被置于常規飼養環境［溫度(24±1)℃，濕度(50±5)%，交替照明12 h，實驗前禁食給水12 h］。動物的處理按照河北北方學院動物中心規定的動物處理和倫理方針進行［4］。

1.3.1 正常組(n=10):0 min開始經由股靜脈連續滴注0.9%氯化鈉溶液(10 m l/h)，并將右頸動脈插管與多導聯生理記錄儀連接，記錄平均動脈壓(MAP)、HR;20 min后經左頸靜脈連續注射0.9%氯化鈉溶液(5 ml·kg-1·h-1)，每20分鐘動態記錄MAP、HR至100 min。

1.3.2 模型組(n=10):0 min開始經由股靜脈連續滴注LPS(10 mg·kg-1·h-1)，并將右頸動脈插管與多導聯生理記錄儀連接，記錄MAP、HR;20 min后經左頸靜脈連續0.9%氯化鈉溶液(5 ml·kg-1·h-1)，每 20分鐘動態記錄 MAP、HR至100 min［4］。

1.3.3 治療組(n=10):0 min開始經由股靜脈連續滴注LPS(10 mg·kg-1·h-1)，并將右頸動脈插管與多導聯生理記錄儀連接，記錄MAP、HR;20 min后經左頸靜脈連續注射黃芪注射液(5 ml·kg-1·h-1)，每20 分鐘動態記錄 MAP、HR 至100 min。

1.4 炎性因子表達的測定 3組大鼠連續觀察結束后，腹主動脈取血，用肝素抗凝(20 U/ml全血)，全血離心取血漿，在50μl血漿樣本或標準品中加入50μl捕獲微球，室溫避光孵育1 h后加入50μl PE標記的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，IL-6檢測抗體，室溫避光孵育2 h，形成“三明治”夾心復合物。孵育完畢后，每管加1 ml洗滌緩沖液(BD Biosciences Pharmingen，USA)進行洗滌。洗滌后上流式細胞儀(FACSCalibur，B.D.Co，USA)檢測炎性因子平均熒光強度，用BD Cytometric Bead Array分析軟件進行結果處理［5］。

1.5統計學分析應用SPSS 11.0統計軟件計量資料以±s表示，采用F檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3 組大鼠MAP的變化 對照組大鼠各時間點MAP差異無統計學意義(P＞0.05);模型組LPS滴注20 min后，與對照組比較，MAP明顯下降(P＜0.05);治療組大鼠40 min MAP開始回升，至60 min MAP顯著高于模型組(P＜0.05)。見表1。

表1 3組大鼠平均動脈壓變化n=10，mm Hg，±s

表1 3組大鼠平均動脈壓變化n=10，mm Hg，±s

注:1 mm Hg=0.133 kPa;與對照組比較，*P ＜0.05;與模型組比較，#P＜0.05

20 40 60 80 100對照組組別LPS注入時間(min)0 103.8±5.9 100±6 99±4 98.2±3.3 97±4 98±4模型組 96.8±3.9 54±7* 56±8* 54.2±6.4* 51±9* 48±9*治療組 99.4±2.7 56±4* 61±4* 70.9±2.0*# 74±4*# 75±4*#

2.2 3 組大鼠HR變化 對照組大鼠各時間點HR差異無統計學意義(P＞0.05);模型組LPS滴注20 min后，與對照組相比較HR明顯上升(P＜0.05);治療組大鼠在40 min HR開始減慢，至60 min心率顯著低于模型組(P＜0.05)。見表2。

表2 3組大鼠HR變化n=10，次/min，±s

表2 3組大鼠HR變化n=10，次/min，±s

注:與對照組比較，*P＜0.05;與模型組比較，#P ＜0.05

20 40 60 80 100對照組組別LPS注入時間(min)0 338±15 325±15 340±18 331±15 345±15 321±17模型組 323±16 412±26* 442±13* 441±13* 464±26* 481±14*治療組 341±32 422±22* 401±18* 376±31*# 382±29*# 391±18*#

2.3 3 組大鼠肛溫變化 對照組大鼠各時間點體溫差異無統計學意義(P＞0.05);模型組在LPS滴注40 min后，與對照組相比較，肛溫明顯上升(P＜0.05);治療組大鼠在40 min肛溫開始明顯上升，至100 min肛溫與對照組比較顯著升高(P＜0.05)。見表3。

表3 3組大鼠肛溫變化n=10，℃，±s

表3 3組大鼠肛溫變化n=10，℃，±s

注:與對照組比較，*P＜0.05;與模型組比較，#P ＜0.05

20 40 60 80 100對照組 36.61±0.13 36.42±0.23 36.36±0.35 36.59±0.24組別 LPS注入時間(min)0 36.32±0.12 36.22±0.22模型組 36.82±0.25 37.15±0.54 38.34±0.57* 38.30±0.73* 38.71±0.45* 38.55±0.66*治療組 37.13±0.24 36.71±0.22 38.77±0.28 39.01±0.61* 38.75±0.76* 39.17±0.82#

2.4 3 組大鼠呼吸頻率變化比較 對照組大鼠各時間點間體溫差異無統計學意義(P＞0.05);模型組在LPS滴注20 min后，與對照組比較呼吸頻率明顯上升(P＜0.05);治療組大鼠在40 min呼吸頻率開始減慢，至60 min呼吸頻率顯著低于模型組(P＜0.05)。見表4。

表4 3組大鼠呼吸頻率變化n=10，℃，±s

表4 3組大鼠呼吸頻率變化n=10，℃，±s

注:與對照組比較，*P＜0.05;與模型組比較，#P ＜0.05

20 40 60 80 100對照組組別LPS注入時間(min)0 77±6 75±8 76±8 78±8 72±11 77±10模型組 82±5 89±8* 91±9* 97±11* 96±10* 96±10*治療組 75±7 77±8*# 85±8*# 89±9*# 89±10*# 91±11*#

2.5 3 組大鼠血漿炎性因子水平 觀察結束后模型組大鼠血漿TNF-α、IL-6的濃度顯著高于對照組，而治療組大鼠血漿TNF-α、IL-6的濃度顯著低于模型組(P＜0.05)。見表5。

表5 3組大鼠血漿炎性因子水平 n=10，ng/L，±s

表5 3組大鼠血漿炎性因子水平 n=10，ng/L，±s

注:與對照組比較，*P＜0.05;與模型組比較，#P ＜0.05

組別 TNF-αIL-6對照組17.7±2.6 22±5模型組 254.2±64.1* 648±183*治療組 141.2±31.9 422±22#

3 討論

本研究證明了在LPS連續滴注可以引起大鼠MAP明顯下降及HR明顯上升，從而造成膿毒性休克，上述改變與時間呈線性關系，并且與對照組呈顯著差異，這與文獻報道［4］相似。此外本試驗還發現，在實驗結束后，模型組大鼠血漿炎性因子水平較對照組明顯升高，治療組給予黃芪注射液連續注射后可以顯著地抑制LPS引起的大鼠MAP的下降，同時減慢HR;降低血漿炎性因子的水平。本實驗證明了黃芪注射液對LPS引發的膿毒性休克具有一定的改善作用。

膿毒性休克是嚴重的膿毒癥的一種表現，其特征為循環系統的衰竭，并伴隨器官衰竭及高病死率［6，7］。由于膿毒癥引發的低血壓可以導致微循環灌注的下降，后者與臟器功能不全及多臟功能衰竭的發生有關［8］。而研究結果顯示TNF-α，IL-6為參與膿毒性休克發生、發展至關重要的促炎因子［9］，與病死率直接相關［10］。因此如何改善患者循環系統的功能及降低體內炎性因子的水平一直是國內外研究膿毒癥休克治療的熱點之一。盡管早在2001國際上提出對重癥膿毒癥及膿毒性休克應進行“早期目標指導治療(EGDT)”的概念［11］，但是膿毒癥患者的病死率依然居高不下。

國內外在利用中醫研究膿毒癥及膿毒性休克方面做出重大貢獻，國內有大量研究顯示黃芪提取物對心肌存在正性肌力作用，具有提高心輸出量，抗心力衰竭，改善心肺功能，增強組織抗缺氧能力，清除自由基，減輕缺血再灌注損傷等功效［3，12，13］。因此本實驗中觀察到經過治療膿毒性休克大鼠循環系統的改善可能與黃芪上述研究結果有關。此外，Shon等［14］研究結果表明黃芪提取物可以有效抑制LPS引發人類羊膜細胞產生IL-6，PGE2及LTC4，這也與我們的研究結果類似。

綜上所述，黃芪注射液可以明顯改善膿毒性休克大鼠MAP及HR，其機制之一可能與降低體內TNF-α，IL-6等促炎因子水平有關，但具體機制有待于進一步研究。

1 Cross AS，Opal SM.A new paradigm for the treatmentof sepsis:is it time to consider combination therapy.Ann Intern Med，2003:138，502-505.

2 Pernerstorfer T，Stohlawetz P，Hollenstein U，et al.Endotoxin-induced activation of the coagulation cascade in humans:effect of acetylsalicylic acid and acetaminophen.Arterioscler Thromb Vasc Biol，1999，19:2517-2523.

3 俞蕾，王志剛，馬應忠，等.黃芪預處理對大鼠心肌再灌注損傷的保護作用.九江醫學，2002，17:4-6.

4 Cheng PY，Lee YM，Wu YS，etal.Protective effectofbaicalein againstendotoxic shock in rats in vivo and in vitro.biochemical pharmacology，2007，73:793-804.

5 Wong CK，Lam CW and Wu AK.Plasma inflammatory cytokines and chemokines in severe acute respiratory syndrome.Clin Exp Immunol，2004，95-103.

6 Sharma S，Kumar A.Septic shock，multiple organ failure，and acute respiratory distress syndrome.Current opinion in pulmonary medicine，2003，9:199-209.

7 Ferrand RA，Herman J，Elgalib A，et al.Septic shock and multi-organ failure in HIV infection-sepsis tuberculosa gravissima.International Journal of STD ＆ AIDS，2006，17:562-564.

8 于亮，段紹斌，居來提，等.黃芪注射液對兩次打擊大鼠致多器官功能障礙綜合征中心肌和血管內皮細胞損傷的影響.中國全科醫學，2010，13:967-970.

9 Abraham E.NF-kB activation.Crit Care Med，2000，28:100-104.

10 Koga K，Ogata M，Takenaka I，etal.Ketamine suppresses tumor necrosis factor-alpha activity and mortality in carrageenan-sensitized endotoxin shock model.Circ Shock，1995，44:160-168.

11 Ressler J，Muzzin A，Knoblich B，et al.Early goal-directed therapy in thetreatment of severe sepsis and septic shock.N Engl JMed，2001，345:1368-1377.

12 王巧云，李金蓮，劉永云，等.黃芪注射液對大鼠靜脈血栓形成的影響.中成藥，2003，25:499.

13 朱子陽.黃芪注射液輔助治療肺心病急性加重期的臨床觀察.中國中西醫結合雜志，2001，21:268.

14 Shon YH，Kim JH，Nam KS.Effect of Astragali radix extract on lipopolysaccharide-induced inflammation in human amnion.Biol Pharm Bull，2002，25:77-80.