何首烏飲對衰老大鼠學習記憶及下丘腦GnRH SPβ-EP含量的影響*

韓廣明, 高曉蘭, 牛嗣云, 高福祿

(1.承德醫學院第二臨床學院, 河北 承 德 067000 2.河北大學基礎醫學部, 河北 保 定 071000 3.河北師范大學生命科學學院, 河北 石家莊 050016)

本研究建立 D-半乳糖所致亞急性衰老大鼠模型,通過 Morris水迷宮行為測試;放射免疫法測定下丘腦 GnRH、P物質、β-內啡肽的含量,探討何首烏飲抗腦衰老的機理。

1 材料和方法

1.1 實驗動物的選擇及分組：選用清潔級 8周齡 SD大鼠 80只,雌雄各半,體重 180-220g(由河北醫科大學實驗動物中心提供)。用生理鹽水將 D-半乳糖配成 6%的溶液,按 300mg/kg.d給藥,除正常組(N)10只外,其余大鼠連續腹腔注射 60 d,每天一次,建立衰老動物模型。然后進行 Morris水迷宮行為測試。潛伏期成績與正常組比較明顯延長,表明模型建立成功。然后將衰老大鼠隨機分為模型組(M)10只、何首烏飲延緩衰老高劑量(Tg)、中劑量(Tz)、低劑量(Td)各 10只、自然恢復組(S-R)10只。何首烏飲組空腹灌胃何首烏飲,按體重每 100g給 0.4mL計算灌藥量,自然恢復組每天灌胃等量的生理鹽水,連續 60 d,每天一次。然后何首烏飲延緩衰老組(高、中、低)劑量組、自然恢復組進行 Morris水迷宮行為測試。

1.2 藥物溶液的制備：何首烏飲方劑組成：何首烏(炙)、肉蓯蓉 、懷牛膝、淫羊霍 、丹參 、茯苓等按重量比3：2：3：2：5：3比例混合,剪碎,水浸泡 1 h,然后水煎 2次,每次 30m in,過濾后濃縮至含生藥分別為 2.4、4.8、9.6 g/m L(分別作為低、中、高劑量藥液)。4℃保存,給藥前復溫至 25-30℃。

1.3 Morris水迷宮行為測試：各組大鼠做 Morris水迷宮測試,定位航行試驗用于測試大鼠空間學習和記憶能力。在連續訓練 5 d,每天訓練 4次,每次隨機選擇一個象限作為入水點,觀察并記錄大鼠爬上平臺的軌跡圖、游泳速度及所需時間(潛伏期)。如果大鼠在60s內未找到平臺,需將其引導至平臺并在平臺上站20 s,此時潛伏期記為 60 s。每只大鼠的訓練間隔為 1 h。空間探索試驗考察大鼠對原平臺的記憶能力。訓練第 6天上午撤除平臺,將大鼠隨機從某一象限池壁中點面向池壁放入水中,記錄 60 s穿越平臺部位的次數。

1.4 標本處理：大鼠用 10%的水合氯醛麻醉,斷頭取出腦組織,迅速投入到液氮中待用。

1.5 下丘腦 GnRH、SP和 β-EP含量的測定：從液氮中取出全腦,用直徑 2.5 mm的套管刀在大鼠腦腹側視交叉后方打孔取下丘腦,組織柱長約 5mm,取一半迅速稱重(約 15 mg)后于 0.5m L 100℃的生理鹽水(沸水浴)中煮沸 3min,加 0.1N鹽酸 0.5mL于勻漿器中制成勻漿,置 4℃1-2 h,再用 0.1N的 NaOH 0.5 m L中和(pH在 6.9-8.4),用 4℃離心機離心 3000 rpm 30min。取上清液。用放射免疫測定法分別檢測GnRH、SP、β -EP。

2 結 果

2.1 Morris水迷宮行為測試

2.1.1 各組大鼠潛伏期成績比較：前 2d各組的成績無顯著性差異,隨學習時間的延長各組潛伏期均逐漸縮短,連續 5 d的定位航行實驗發現,模型組、自然恢復組的潛伏期成績與正常組比較明顯延長(P＜0.01),表明模型建立成功,模型組、自然恢復組的潛伏期成績無差別(P＞0.05)。何首烏飲組第 3天后的潛伏期與模型組比較均有顯著性差異(P＜0.01)。其中何首烏飲高劑量組明顯好于其余各組(P＜0.05),見表 1。

表 1 各組大鼠在定位航行試驗中平均逃避潛伏期的比較(±s,n=8)

表 1 各組大鼠在定位航行試驗中平均逃避潛伏期的比較(±s,n=8)

vs M：1)P＜0.01,2)P＜0.05;vs Tw：3)P＜0.05

組別 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天N 52.32±10.04 43.40±12.601) 22.16±5.661)3) 16.23±6.601)3) 8.91±1.591)3)M 57.26±2.50 51.25±3.45 41.75±13.893) 34.84±3.073) 30.05±6.393)Tg 55.12±10.19 42.49±10.881) 26.28±9.661) 18.23±3.621) 9.71±1.511)3)Tz 55.89±10.08 42.19±4.331) 28.33±9.661) 25.29±7.301) 15.91±5.221)3)Td 56.11±7.08 43.66±11.391) 30.16±9.111) 23.11±8.161) 22.11±7.121)S-R 56.77±2.97 47.69±5.25 39.75±6.443) 33.33±6.023) 26.07±3.361)3)

2.1.2 各組小鼠空間搜索實驗結果：正常組穿越平臺的次數(7.11±1.36)次/min,明顯高于模型組(2.36 ±0.38)次 /m in、自然恢復組(2.69 ±0.29)次/min(P＜0.01);模型組與自然恢復組穿越平臺的次數無明顯差別(P＞0.05);何首烏飲高組(6.93±1.06)次 /min、中組 (4.29 ±1.99)次 /min、低組(3.71±1.77)次/min穿越平臺的次數與模型組比較顯著增多(P＜0.01)。其中何首烏飲高劑量組次數明顯多于其余各組(P＜0.05)。

2.2 下丘腦 GnRH、SP和 β-EP含量

2.2.1 下丘腦 GnRH、SP含量：模型組下丘腦 GnRH、SP明顯增高,與正常組相比有顯著性差異(P＜0.01),何首烏飲可改善下丘腦 GnRH、SP的分泌。何首烏飲高劑量組要好于其他各組(P＜0.05),見表 2。

2.2.2 下丘腦 β-EP含量：模型組下丘腦 β-EP明顯降低,與正常組相比有顯著性差異(P＜0.01),何首烏飲可改善下丘腦 β-EP的分泌。何首烏飲高劑量組要好于其他各組(P＜0.05),見表 2。

表 2 各組大鼠下丘腦 GnRH、SP、β-EP含量的比較(±s,n=5)

表 2 各組大鼠下丘腦 GnRH、SP、β-EP含量的比較(±s,n=5)

vs M：1)P＜0.05,2)P＜0.05;Tw：3)P＜0.05

)N 289.11±23.161)3) 3.71±1.421)3) 22.44±2.341)3)M 543.66±19.953) 6.11±2.773) 13.34±2.483)Tg 302.94±13.511)3) 3.73±0.311)3) 24.34±1.481)3)Tz 403.68±37.991)3) 4.70±1.091) 19.78±1.961)3)Td 520.33±47.193) 5.23±0.052) 16.54±3.132)S-R 570.94±32.003) 6.89±0.413) 12.09±1.47

3 討 論

人類衰老的主要表現是精力衰退、智力下降、記憶力下降;目前研究表明：腦內存在著調控衰老的結構和機制,稱為“衰老鐘”,下丘腦神經內分泌系統可能就是“衰老鐘”的所在部位[1]。

在衰老過程中,下丘腦出現的一系列結構和功能的改變是導致機體神經內分泌系統紊亂的主要原因。Urban[2]研究發現：下丘腦神經元分泌單胺類神經遞質活性下降與性腺軸衰老有關。下丘腦產生多種神經遞質及神經肽均參與了 GnRH(gonadotrop h in hormone-releasing hormone)合成和分泌的調節,并共同完成機體對神經內分泌的調節[3]。衰老時下丘腦內神經遞質及神經肽的含量發生相應的增齡變化,其平衡遭到破壞,并與一些老年疾病如帕金森病、老年癡呆及腦功能減退有關[4-6]。本研究證明,衰老大鼠下丘腦GnRH、P物質(Substance P,SP)的含量均增高,而下丘腦 β-內啡肽(β-endorphine,β-EP)含量代償性下降。改善中樞神經遞質的代謝可顯著彌補或扭轉學習記憶的障礙[7]。本實驗顯示何首烏飲可明顯改善衰老模型大鼠的學習記憶能力及下丘腦 GnRH、SP明顯增高,β-EP明顯降低,提示何首烏飲可有效調整中樞神經遞質的合成,恢復下丘腦、海馬內神經遞質的平衡,改善了下丘腦及海馬神經內分泌細胞的功能。因此說明何首烏飲具有良好的延緩衰老的作用。

[1] 張樟進,王小民.下丘腦的衰老[J].生理科學進展,1991,22：304.

[2] Urban RJ.Neuroendocrinology of aging in themale and female[J].Endocrinol Metab Clin North Am,1992,21(4)：920-931.

[3] Lee JJ,Chang CK,Liu IM,et al.Changes in endogenous monoamines in aged rats[J].Clin Exp Pharmacol Physiol,2001,28(4)：285-289.

[4] Moll GH,Mchnert C,Wicker M,et al.Age-associated changes in the densities of presynap tic monoam ine transporters in different regions of the rat brain from early juvenile life to late adulthood[J].Brain Res Dev Brain Res,2000,119(2)：251-257.

[5] Backman L,Farde L.Dopam ine and cognitive functioning：brain imaging findings in Humtington's disease and normal aging[J].Psychol,2001,42(3)：287-296.

[6] Edagawa Y,Saito H,Abe K.Endogenous serotonin contributes to a developmental decrease in long-term potentiation in the rat visual cortex[J].Neurosci,2001,(5)：1532-1537.

[7] Lee JJ,Chang CK,et al.Changes in endogenousmonoamines in aged rats[J].Clin Exp Pharmacol Physiol,2001,28(4)：285.