萊菔硫烷對人肝癌HepG-2細胞ERK信號通路的影響

鄒 翔，曲中原，白 晶，季宇彬，

(1.哈爾濱商業(yè)大學生命科學與環(huán)境科學研究中心，哈爾濱150076;2.國家教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心，哈爾濱150076;3.哈爾濱商業(yè)大學中藥學博士后流動站，哈爾濱150076)

萊菔硫烷(sulforaphane，SFN)是迄今為止在蔬菜中發(fā)現的防癌抗癌效果最好的天然活性成分之一［1－2］，廣泛存在于十字花科植物中，在綠花椰菜中含量最高［3－5］.研究表明，SFN可通過阻斷化學物誘發(fā)腫瘤的起始階段，能完全抑制I相酶，并且誘導II相解毒酶的表達而有效預防多種癌癥的發(fā)生［6－7］.以往研究表明，SFN可通過誘導HepG-2細胞發(fā)生G2/M期阻滯及凋亡顯著抑制人肝癌HepG-2細胞的增殖［8－9］，本文通過研究SFN對人肝癌HepG-2細胞中ERK和p-ERK蛋白表達的影響，探討ERK1/2 MAPK信號轉導途徑在SFN誘導HepG-2細胞凋亡中的作用.

1 材料與方法

1.1 細胞

人肝癌HepG-2細胞株，由哈爾濱商業(yè)大學藥物研究所博士后科研工作站傳代保種.

1.2 藥品和試劑

萊菔硫烷(分子式C6H11NOS2，相對分子質量為177.3，純度98.3%)，美國Alexis公司，用前以二甲基亞砜(DMSO)溶解，－20℃保存，臨用時加培養(yǎng)液稀釋至所需濃度，使DMSO終質量分數不超過0.1%;阿霉素(批號080907)，浙江海正藥業(yè)股份有限公司;RPMI-1640培養(yǎng)基干粉，美國GIBCO公司;胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)，美國Sigma公司;鼠抗P44/42 MAPK抗體、鼠抗p-P44/ 42MAPK抗體、堿磷酶標記馬抗鼠IgG，碧云天公司;其他試劑均為國產分析純.

1.3 實驗儀器

CO2培養(yǎng)箱，日本Sanyo公司;低溫高速離心機，美國Beckman-Coulter公司;水平電泳儀、電轉儀，美國Bio-Rad公司;超凈工作臺，蘇凈集團.

1.4 細胞培養(yǎng)

人肝癌細胞系HepG-2常規(guī)細胞復蘇后，培養(yǎng)于含有10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于CO2培養(yǎng)箱(37℃，體積分數為5%的CO2，相對濕度95%)培養(yǎng).2～3 d傳代1次，取對數生長期細胞進行實驗.

1.5 Western Blotting方法檢測SFN對HepG-2細胞內ERK和p-ERK蛋白表達的影響

將對數生長期細胞用胰酶消化后，傳代培養(yǎng)于細胞培養(yǎng)瓶，24 h貼壁后給藥.各給藥組設計為:給藥組(SFN終濃度10、20、40 μmol/L)、空白對照組(加等體積RPMI 1640)、陽性對照組(ADM終濃度0.5 μmol/L).48 h后，收集細胞，用預冷的PBS洗2～3次、離心，加入裂解液冰上裂解1.5 h，4℃、12 000 r/min離心10 min提取總蛋白.570 nm處測定吸光度，計算蛋白含量，并用細胞裂解液將各樣品調至相同濃度.配制5%的濃縮膠及12%的分離膠進行SDS-PAGE電泳.電泳條件:濃縮膠80 V，待樣品前沿進入分離膠后調電壓至100 V.轉膜條件:200 mA恒流轉膜60 min.將凝膠中的蛋白轉移到NC膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，加一抗過夜.次日，取出NC膜用TBST緩沖液充分振搖洗膜3次，每次10 min.加堿磷酶標記馬抗小鼠IgG室溫孵育2 h后，TBST振搖洗膜3次，每次10 min.加顯色液顯色，Tannon凝膠成像系統照相.掃描圖像在天能GIS凝膠成像分析系統進行量化分析.

1.6 統計學處理

實驗均重復3次，數據結果均以ˉx±S表示，并采用SPSS 15.0統計軟件分析，組間均數比較采用單因素方差分析.

2 實驗結果

實驗結果如圖1～4所示.結果表明，隨著SFN濃度的增加，HepG-2細胞內ERK蛋白表達并無顯著改變;而p-ERK蛋白表達卻逐漸降低，各組與對照組比較，差異均具有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01).

圖4 SFN對人肝癌HepG-2細胞內ERK蛋白表達的影響

3 討論

SFN具有卓越的化學預防作用，其防癌抗癌作用機制的研究已成為近年來國內外的研究熱點.以往研究表明，SFN可在腫瘤發(fā)生的多個階段發(fā)揮防癌作用.而近年來研究發(fā)現，萊菔硫烷還可直接殺傷腫瘤細胞.本文前期研究發(fā)現，SFN可抑制HepG-2細胞的增殖，并可通過下調Bcl-2的表達、上調Bax的表達進而啟動線粒體凋亡途徑，最終啟動Caspase級聯反應誘導HepG-2細胞凋亡，此為SFN抗人肝癌細胞增殖的主要機制［7－8］.

MAPKs家族是細胞表面信號轉導至細胞核的重要傳遞者，已成為近年來研究的熱點之一.其中，細胞外調節(jié)蛋白激酶ERK1/2是第一個被克隆的MAPKs家族成員，與細胞增殖最為密切，是細胞外多種刺激傳向細胞內的交匯點［10］.大量資料表明，用ERK的顯性失活突變體能夠阻斷Fas介導的細胞凋亡，說明ERK還參與細胞凋亡的調控.ERK通路可通過磷酸化p53、增強TNF-α表達來介導細胞凋亡，還可以參與Bcl-2，Caspase家族介導的凋亡.而本課題研究發(fā)現，SFN可下調人肝癌HepG-2細胞內p-ERK的表達進而抑制ERK通路.這一結果說明，SFN下調細胞內Bcl-2蛋白表達水平，進而降低Bcl-2/Bax的比率、促進HepG-2細胞通過線粒體途徑凋亡的作用可能與其抑制ERK通路有關.但SFN抑制HepG-2細胞ERK通路的具體分子機制還有待進一步研究.

［1］ 季宇彬，鄒 翔，李 雷.十字花科植物中異硫氰酸鹽的性質及活性研究［J］.哈爾濱商業(yè)大學學報:自然科學版，2007，23(4):385－390.

［2］ 季宇彬，池文杰，鄒 翔，等.西蘭花中異硫氰酸鹽誘導人肝癌細胞HepG－2凋亡作用及其機制的研究［J］.中國中藥雜志，2007，32(7):612－615.

［3］ 季宇彬，武曉丹，鄒 翔.西蘭花中葡萄糖異硫氰酸鹽誘導HepG－2細胞凋亡［J］.中國天然藥物，2007，5(4):293－296.

［4］ 季宇彬，池文杰，鄒 翔，等.西蘭花中蘿卜硫素提取、分離與抗癌活性研究［J］.哈爾濱商業(yè)大學學報:自然科學版，2005，21(3):270－273.

［5］ 鄒 翔，郎 朗，武曉丹，等.西蘭花中葡萄糖異硫氰酸鹽誘導人胃腺癌SGC－7901細胞凋亡的初步研究［J］.中草藥，2007，38(2):228－231.

［6］ 孫勝男，鄒 翔，高 鵬，等.萊菔硫烷誘導人肝癌HepG－2細胞凋亡的p38MAPK途經研究［J］.藥物評價研究，2009，32(1):29－33.

［7］ 季宇彬，高 鵬，鄒 翔，等.萊菔硫烷通過線粒體誘導HepG－2細胞凋亡［J］.哈爾濱商業(yè)大學學報:自然科學版，2009，25(6):641－644.

［8］ 鄒 翔，曲中原，高 鵬，等.萊菔硫烷對人肝癌HepG－2細胞Bcl－2與Bax基因轉錄及蛋白表達的影響［J］.上海中醫(yī)藥大學學報，2010，24(2):76－80.

［9］ 鄒 翔，曲中原，高 鵬，等.萊菔硫烷誘導HepG－2細胞G2/M期阻滯及其對Cdk1和CyclinB1蛋白表達的影響［J］.中醫(yī)藥學報，2010，38(2):8－12.

［10］ DIASINOU F，PAUL D S，JOHN H B.The 5－HT－and FMRFa－activated signaling pathways interact at the level of the Erk MAPK cascade:Potential inhibitory constraints on memory formation［J］.Neuroscience Letters，2006，396(3):235－240.